雪旺细胞的分离培养与纯化

　　1 雪旺细胞的分离及培养

　　雪旺细胞原代培养的方法主要包括单层细胞培养法和组织块培养法两种[3].其中，单层细胞培养法又称为分散培养法或酶消化培养法。雪旺细胞培养的基本过程为：①分离神经段，并通过机械或酶消化法除去神经外膜；②离心神经段，收集细胞进行初步培养及纯化；③进行传代培养，尽可能抑制成纤维细胞的生长及保持雪旺细胞较长时间的增殖能力。

　　1.1 单成细胞培养法

　　单层细胞培养法又称分散培养法或酶消化培养法，是根据组织中含有一定量的细胞间质（纤维、基质），防碍细胞生长，用酶消化后能去除间质，使组织松散，细胞间的连接分开，从而分离成单个细胞或较小的细胞团，接种后细胞在培养皿上呈单层，易于生长的原理。目前，酶消化培养法包括单酶消化法和双酶消化法，主要采用胰蛋白酶和胶原酶。

　　Fansa 等[4]首先采用双酶消化法对大鼠坐骨神经进行消化，即用胰蛋白酶和胶原酶共同消化神经段 30~40 min,其消化后活细胞百分率达 95 %以上。为了避免双酶混合液长时间对雪旺细胞的损伤，Fansa 等[5]又尝试用单胶原酶消化处理大鼠坐骨神经。其优点是胶原酶可在含血清的 DMEM 培养基中进行长时间消化，且尽量避免损伤雪旺细胞。然而，这种方法虽然解决了胰蛋白酶对细胞膜的损害作用，但是消化时间较长，而长时间消化也会破坏细胞膜。因此，宁仁德等[6]对非同步的双酶消化法进行了尝试，即先用胰蛋白酶消化乳兔坐骨神经 30 min,随后用胶原酶进行消化，消化时间 30~40min.非同步双酶消化后，活细胞百分率达 95 %以上。此种方法减少了对雪旺细胞的损害，且活细胞百分率较高[7].酶消化法培养雪旺细胞省时，所得的细胞为原代细胞，细胞的产量也较高。但由于酶的作用，增加了对细胞的毒害，可能会使雪旺细胞的功能受到一定的影响。

　　1.2 组织块培养法

　　组织块培养法是利用组织切割成 0.5-1 mm3的小块，由于组织块体积较小，在不加任何粘加剂的情况下，能直接贴附于瓶壁上，细胞自组织块边缘向外长出，最后连接成单层细胞的方法。Askans[8]于 1980 年首次报道了组织块培养法，1989 年 Oda[9]将该法加以改进，将神经分成直径 150~200μm 的细束，使成纤维细胞在两天内迁移出来，克服了退化也减少了雪旺细胞的丢失。1995 年丛国辉等[10]对兔坐骨神经用组织块反复种植的方法培养雪旺细胞，取得了成功。冯广友等[11]
对成年大鼠背根神经节来源的雪旺细胞用组织块培养法进行培养，取材后采用阿糖胞苷抑制成纤维细胞的生长，结果雪旺细胞的纯度达到 90 %.组织块培养法培养雪旺细胞的优点是方法简便易行，避免了酶对细胞的不良影响；雪旺细胞的分离、培养及纯化罗丽花，但是这种方法比较费时，细胞纯化的周期较长，细胞的产量低，且获得的细胞纯度也不是很高。

　　2 雪旺细胞的纯化

　　由于雪旺细胞的培养主要取材于周围神经（如坐骨神经等），而周围神经的内膜和外膜均含有大量的成纤维细胞（fibroblast,Fb），且在解剖镜下也只能将外膜剔除干净，所以在雪旺细胞的培养过程中不可避免的要碰到 Fb 污染的问题。因此，在解剖周围神经的过程中除了要尽量剔除神经外膜之外，在培养过程中，也应尽早采取其它办法杀死或剔除 Fb,以达到纯化雪旺细胞的目的。

　　2.1 组织块培养法

　　组织块培养法是利用 Fb 从组织中迁移快，而 SC 迁移慢的原理，将解剖好的坐骨神经切成 1 mm3左右的小块，然后接种于涂有胶物的培养皿上，2~3 d 后，组织块周围长满细胞后，便将组织块移植另一个培养皿中，如此反复移植 3~5 次，即可得到纯度较高的雪旺细胞。组织块培养法的关键是组织块必须贴壁，且组织块的大小必须适当，取培养液观察或换液时动作要轻稳，培养皿内组织块的数量和组织块间的距离应适当。吴利标等[12]利用组织块反复种植法来纯化培养的雪旺细胞，随着组织块种植培养的次数越多，雪旺细胞在新长出的细胞中的比例就越大，所得到的雪旺细胞的纯度就越高。

　　2.2 酶消化培养法

　　酶消化培养法是利用酶的消化作用使得细胞间的连接分开，细胞得以分离，移植后的细胞在培养皿上呈单层，然后再用以下方法加以纯化。

　　2.2.1 粘附、剔除 Fb 的物理方法

　　差速贴壁法，是目前国内外常见的物理纯化法，即在培养皿上涂多聚赖氨酸，同样利用 Fb 贴壁快，SC 贴壁慢的特点，将 Fb 除去。差速贴壁中又以双 30 min 差速贴壁为主，用此方法纯化后的雪旺细胞的纯度可达到 90 %左右。由于不加抗有丝分裂剂和补体，因而对其后的 SC 和 Fb 的生长无抑制影响。Kreider 和 Messing[13]等通过差速贴壁法，利用成纤维细胞贴壁快，雪旺细胞贴壁慢的特点，将乳鼠坐骨神经培养的雪旺细胞中的成纤维细胞除去，从而得到纯度较高的雪旺细胞。

　　2.2.2 利用化学试剂杀死 Fb 的方法

　　1976 年 Wood[14]首次报道使用抗有丝分裂剂阿糖胞苷（Ara-c）和氟脱氧尿嘧啶核苷（UDF）来抑制 Fb 生长以达到纯化 SC 的目的。随后 Brockes 等依据 Fb 表面含有胸腺素 -1（Thy-1）抗原，而 SC 不表达这种抗原的原理，在培养液中加入 Thy-1 抗血清，使其与 Fb 的 Thy-1 抗原结合，再引入免疫补体，从而溶解 Fb.以上两种方法获得的雪旺细胞纯度较高，但是对雪旺细胞均有一定的影响。1983 年 Lim 等将方法改良，在 Fb 和 SC 的细胞悬液中加入抗 Thy-1 抗体，37 ℃孵育 30 min,然后转到含抗 IgG 的培养基上，这样 Fb就被粘附在培养基上，最后再将 SC 悬液吸出重新接种。这种免疫粘附方法纯化效果最好，其纯度可达 99.5%,但是所需的试剂价格高，不适合数量多，常规雪旺细胞的纯化。于是，1990 年 Armatic 等采用新的方法，根据 Fb 和 SC 的生长均需要 D- 缬氨酸（D-Valine），在培养过程中，向培养液中加D-Valine,SC 含有 D-Valine 氧化酶，它可将 D-Valine 转化成 L-Valine,而 Fb 缺乏此酶，没有这种转化功能，Fb 的生长便可受到抑制。另外，韩岩等[15]利用对雪旺细胞毒副作用较小的 Geneticin 培养液纯化雪旺细胞，培养 4~5 d 后即可得到纯度较高的雪旺细胞，改用普通培养液培养后雪旺细胞仍能正常增殖，并可转代生长。近年来大多联合应用前述几种方法来纯化培养的雪旺细胞，如 2002 年 Calderon 等[16]采用酶溶解和 Ara-C 抑制法成功地对从成人外周神经获取的雪旺细胞进行扩增、繁殖。

　　综上可知，雪旺细胞分离纯化的方法有多种，如组织块培养法、差速贴壁法、抗有丝分裂法、酶溶解法、免疫选择法等。各种方法都有其各自的优缺点，所以要根据自己实验的需要和实验室的条件来选择合适的纯化方法，从而得到高纯度的雪旺细胞。

　　参考文献：
　　[1] 吴志伟 ,陈峥嵘 .周围神经组织工程进展 [J].复旦学报 ,2004,31（1），103-106.
　　[2] 顾立强 ,秦煜 ,叶震海 .雪旺细胞与周围神经组织工程 [J].现代康复 ,2001,5（8），24-25.