抗HIV-1活性肽及肽类似物的研究进展(2)

　　3 融合抑制剂

　　Gp41 蛋白可分为膜外区、跨膜区、胞质区 3部分。膜外区直接参与融合，含 3 个重要功能片段：

　　一个是 N 端的融合肽 FP,另外两个均为 4,3 七残基疏水重复序列，即 N 末端重复序列（NHR）和 C末端重复序列（CHR）。NHR 和 CHR 间是含两个Cys 的环状结构。X 射线分析表明，NHR 和 CHR能以反向平行方式聚集而形成 Gp41 介导膜融合的6-HB[13].6-HB 的 NHR 三聚体表面存在一疏水性口袋区，能与 CHR 区的 3 个保守疏水残基相互作用以维持 6-HB 的稳定性[14].与存在变异性的 Gp120相比，Gp41 序列的保守性很强，以 Gp41 作为靶点有其优越性和合理性。

　　3.1 C 肽类融合抑制剂

　　C 肽衍生于 Gp41 的 C 端，能同 Gp41 的 N 螺旋结合而阻止正常三聚体发夹结构的形成。由于NHR 区域的基序高度保守，C 肽类抑制剂具有极好的研发前景。20 世纪 90 年代初，杜克大学和麻省理工学院的研究小组分别报道了恩夫韦地和 C34,前者被开发上市。C 肽类融合抑制剂见表 1.

　　3.1.1 小分子–多肽缀合物 C34 由于水溶性低，未被开发成抗艾滋病药物，但在测试活性和研究机制方面发挥重要作用[15].Wang 等[16]

　　将作用于 NHR三聚体表面的疏水口袋的 NB-2 衍生物 Noc[2-氧乙酸基-4-（2,5-二甲基吡咯基）-苯甲酸]或 Npc[1-（4-羧基-3-羟苯基）-2,5-二甲基吡咯-3-羧酸]与衍生于 C34的多肽 P26 缀合，缀合物中的小分子和多肽部分由于作用于不同部位而具有协同效应，使缀合物的融合抑制活性达到低纳摩尔水平，且对恩夫韦地的耐药株有抑制效果。此外，缀合物对蛋白酶的稳定性优于恩夫韦地和 C34.随后，研究小组获得的 NB-2衍生物与C34衍生的多肽P27的缀合物也被发现有低纳摩尔水平的抑制活性[17].

　　3.1.2 T 系列多肽 经 FDA 批准上市的多肽类融合抑制剂恩夫韦地（T-20），是由 Roche/Trimeris 公司合成的含 14 种不同 L 型天然氨基酸的 36 肽。恩夫韦地与 Gp41 有很强的亲和力，能和 NHR 三聚体螺旋的疏水槽结合来干扰 6HB 的形成，阻断 HIV-1 与宿主细胞膜之间的融合，从而抑制 HIV 的感染[18].

　　但恩夫韦地只对活化中间体起抑制作用，对已活化的和已形成的核心三聚体发夹结构无相互作用[19].恩夫韦地单独使用或与其他抗 HIV-1 药物合用均疗效显着，恩夫韦地与蛋白酶抑制剂或逆转录酶抑制剂有协同作用，能有效抑制 HIV-1 感染，还能降低各种药物的使用量和毒性。

　　T-1249 是同家公司开发的第二代肽类融合抑制剂，含有 39 个 L-氨基酸，肽链由 HIV-1、HIV-2 及猿免疫病毒 SIV 的 CHR 序列共同组成[20],和恩夫韦地有极大相似度。T-1249 的 N 末端氨基酸残基37、38 突变会产生耐药性，但耐药模式的不同使T-1249 对恩夫韦地有耐药性的病毒株也有效[21].由于T-1249在N端增加了和NHR三聚体表面的疏水性口袋区结合的片段，活性较恩夫韦地增大了一个数量级，但研发公司于 2004 年暂停了Ⅱ期临床研究。

　　T-2635、T-1144 是经 CHR 序列多肽 T-651 修饰得到的第三代融合抑制剂。生物物理分析与结构分析发现，C 肽采用 α-螺旋构象完成结合[24] .研究证实，通过稳定肽抑制剂中的 α 螺旋结构能显着提高其抗病毒活性。经合理设计得到的 T-2635 有稳定的α-螺旋结构，对 NHR 上的作用位点显示出极高的亲和力，使病毒株的耐药性降低。外周血单个核细胞的分离测试表明，T-2635 抑制病毒复制 IC50值达0.214 μg/mL,而恩夫韦地相应 IC50值为22.96 μg/mL.

　　不同代的 C 肽融合抑制剂含不同的功能领域，与Gp41 的 NHR 或脂质膜作用的方式也不同[25],T-1144、T-2635 均被发现对恩夫韦地耐药株有抑制活性。通过组合使用不同代的肽融合抑制剂能引起强烈的协同效应[26-27],如恩夫韦地和 T-1144 组合使用能提高 5~20 倍抑制活性[26].研究者设计了一个恩夫韦地和 T-1144 共价连接的嵌合体肽 TLT[28],它具有高度螺旋性，并且能抗蛋白质水解，但没有恩夫韦地和 T-1144 单独使用时的抑制活性高。

　　3.2 N 肽类融合抑制剂

　　N 肽衍生于 Gp41 的 N 端，N 端的直接衍生肽有 DP-107[29]、N36 等，活性比 C 多肽低。N 肽的作用机制主要分两种：一是和 Gp41 的 CHR 结合；二是和Gp41的NHR结合成三聚体以抑制同源三聚体形成。N 肽嵌合肽 IQN 系列和 IZN 系列具有极好的水溶性，解决了 N 肽聚集度高的问题，能获得稳定的三聚体，随后连接到 CHR 螺旋束来阻断 CHR和 NHR 的结合[15].N 肽类融合抑制剂见表 2.

　　3.2.1 IQN 系列 Eckert 等[1]将一螺旋三聚体GCN4-pIQI′融合到 Gp41 的 N 螺旋区域得到 IQN 系列肽。其中，IQN17 端的29 个残基来自螺旋三聚体，而最后17个残基来源HIVHXB2株的Gp41N螺旋区域，其抑制 HIV 侵入 IC50值达 190 ng/mL.研究发现，多肽的活性和螺旋三聚体稳定性有关。通过在 HXB2Gp41 的N区域插入残基，获得了高度螺旋化的IQN23、IQN36,抑制 HIV 侵入的 IC50分别达15、88ng/mL[29].

　　3.2.2 IZN 系列 研究者将螺旋三聚体 IZm 融合到Gp41 的 N 螺旋区域得到了 IZN 系列，病毒感染测试发现，IZN17、IZN23、IZN36 的 IC50值分别达到22、30、26 ng/mL[1].比较发现，增加 N 肽嵌合肽Gp41 部分的序列长度、提高螺旋三聚体的热稳定性可以增加抑制活性。Bianchi 等[30]用间二硫键来共价地稳定 IZN17,解决了 IZN17 的抗病毒效力受自缔平衡限制的问题，得到了三聚体结构 CCIZN17,细胞融合测试发现其 IC50值达 260 pg/mL.此外，经单周期病毒感染检测发现，CCIZN17 抑制 HIVHXB2、NL4-3、MN-1 的 IC50值在 40~380 pg/mL.

　　综合来看，CCIZN17 的效力与恩夫韦地相当，甚至更高。CCIZN17 还被发现与恩夫韦地有协同作用，具有开发潜力。

　　3.3 其他肽类衍生物

　　3.3.1 D 型肽 Eckert 等[31]以 Gp41 的疏水口袋区为靶标，利用镜像噬菌体展示法合成了具有 Gp41的疏水口袋区结构的 D-IQN17,以此筛选肽库并用D-氨基酸合成相应的 D-型肽。由于非天然的 D-型肽不会被内源性蛋白酶降解，有望被开发成口服抗HIV-1 肽类抑制剂。

　　3.3.2 VIR-576 VIRIP 是含 20 个氨基酸的抗胰蛋白酶序列片段，能通过结合 Gp41 的 N 端融合肽 FP来阻止 FP 对细胞膜的插入，进而阻断融合过程，它对包括现有逆转录酶抑制剂耐药毒株在内的多种HIV-1 毒株的复制均有抑制效果[32] .在Ⅰ、Ⅱ期临床研究中，VIR-576 成功地使 HIV-1 感染者的血浆病毒载量的降低量超过一个数量级，且无严重不良反应发生[33].VIR-576 有望被用于杀微生物剂的研究，发挥局部预防 HIV-1 性传播的作用[34-35].数据显示，对 VIRIP 进行结构改造得到的 VIRIP 衍生物的抑制活性能达纳摩尔水平。

　　4 展望

　　目前在临床治疗中广泛应用的高效抗逆转录病毒治疗方法有显着疗效，但也存在严重的毒副作用和耐药性问题。深入研究艾滋病感染过程，寻找新的作用靶点和作用机制，研发高效低毒且不易耐药的药物[36]、开发新的治疗方法迫在眉睫。肽类药物具有活性高、毒副作用小、特异性高等优势，在抗HIV 药物治疗领域，肽类化合物是 HIV 侵入抑制剂的热点研究方向。以药物靶点的结构和作用机制为基础，通过合理药物设计和筛选等手段发现高活性及选择性的肽类抑制剂，并注重对肽类化合物进行结构修饰，以改良给药途径和改善药动学性质，将是今后抗 HIV 药物研究的主要方向。

　　参考文献

　　[1] Eckert D M, Kim P S. Design of potent inhibitors ofHIV-1 entry from the gp41 N-peptide region [J]. ProcNatl Acad Sci U S A, 2001, 98（20）： 11187-11192.

　　[2] Ingallinella P, Bianchi E, Ladwa N A, et al. Addition of acholesterol group to an HIV-1 peptide fusion inhibitordramatically increases its antiviral potency [J]. Proc NatlAcad Sci U S A, 2009, 106（14）： 5801-5806.

　　[3] White J M, Delos S E, Brecher M, et al. Structures andmechanisms of viral membrane fusion proteins: multiplevariations on a common theme [J]. Crit Rev Biochem MolBiol, 2008, 43（3）： 189-219.

　　[4] Bastian A R, Contarino M, Bailey L D, et al. Interactionsof peptide triazole thiols with Env gp120 induce irreversiblebreakdown and inactivation of HIV-1 virions [J].Retrovirology, 2013, 10: 153.

　　[5] Wu Z, Cocchi F, Gentles D, et al. Human neutrophilalpha-defensin 4 inhibits HIV-1 infection in vitro [J].FEBS Lett, 2005, 579（1）： 162-166.