对体外培养的髁状突软骨细胞施加张应力观察其生长

　　引言 Introduction

　　功能矫形治疗是口腔正畸学中矫治患者下颌发育不足、后缩畸形的主要方法。颞下颌关节是人体关节中能保持终生改建的惟一关节，而髁状突软骨作为下颌骨的主要生长中心，对矫形力的反应直接而又敏感，是临床功能矫形治疗的主要功能区域，同时也是功能矫正器治疗下颌后缩畸形的生物学理论基础。多种因素可以诱发髁突改建如创伤、增龄性变化、颞下颌关节盘移位等，同时也是功能矫正器治疗下颌后缩畸形的生物学理论基础。是在使用功能矫正器对下颌后缩畸形的临床矫正中，下颌向前移位，牵拉颞下颌关节韧带，将应力作用于颞下颌关节，髁突软骨在所承受之力的不断作用下，发生相应的改建，髁状突在功能矫形下获得的垂直方向和水平方向的生长对于下颌后缩的改善起到有效而且持久的作用。Chen等研究中改变应力加载模式能对髁状突软骨产生不同的生长刺激，髁状突软骨内各种生长因子水平发生不同变化。Ng等研究中，重复的机械力刺激可以增加髁状突软骨中Ihh因子表达，而Ihh信号传导通路在软骨骨化成熟过程中起到关键作用。但是由于在体内实验过程中，细胞力学的功能研究因其所处生理环境的复杂性、刺激因素传导的不定向性，应力刺激对髁状突软骨细胞的直接影响需要进一步实验研究。

　　髁状突软骨细胞是下颌骨生长、髁状突改建及创伤后修复的主要细胞，功能负荷改变诱导组织中的间充质细胞增殖并分化为成软骨细胞，再继续分化为成熟的软骨细胞，形成软骨组织。髁突软骨通过自分泌和旁分泌形式产生的细胞因子，形成复杂的代谢调控分子网络，各种细胞因子之间相互拮抗或协同作用，调节酶及其抑制剂的活性，共同对软骨的代谢进行调控。在促进髁突软骨生长改进的应力作用下，促进细胞生长和基质形成的细胞因子表达增强；在异常应力的作用下，抑制细胞生长、促进基质降解的细胞因子表达增强。正畸治疗下颌后缩畸形中，功能矫治器通对髁突施加一定的张应力刺激，引导其相应的生长因子调节下颌髁突生长来矫治下颌骨发育不足。

　　为了对髁状突软骨细胞在张应力下的反应做进一步探讨，文章采用应力加载装置对体外培养的髁状突软骨细胞施加一定的张应力，分析其生长改变，进一步阐述功能性矫正器对于下颌后缩的病例的矫正机制。

　　1 材料和方法 Materials and methods

　　设计：细胞学体外实验。

　　时间及地点：于2012年1月至2013年12月在青岛大学附属医院中心实验室完成。

　　材料：

　　实验动物：健康2周龄新西兰白兔1只，雌雄不限，购 自 山 东 鲁 抗 医 疗 公 司 ， 动 物 许 可 证 号 ： slxk-lu-20100109 。 实 验 过 程 中 对 动 物 的 处 置 符 合 2009 年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

　　实验设备：多通道细胞牵张应力加载系统由通讯作者袁晓博士与哈尔滨工业大学共同研制，应用Flexcell公司生产的BF-300lU BioFlex弹性膜6孔培养板作为细胞培养单元，动力加载单元使用VCA5038B型微型真空泵，并采用C8051f410单片机作为控制核心，通过编制相应的单片机程序，从而实现多通道细胞牵张应力的检测与控制，根据对多通道细胞牵张应力控制实验系统的设计要求，系统压检测范围：0-25 kPa；可以提供0-20%的形变率，应变频率在0-0.5 Hz内可调。【表】

　　
　　方法：

　　细胞培养：选取2周新西兰白兔，麻醉后局部消毒取髁状突软骨，用PBS充分漂洗3次，将软骨用手术剪剪至1 mm3大小，PBS冲洗2次。加0.25%胰蛋白酶大约3 mL至培养板中消化软骨组织，5-10 min震荡混勾1次，消化30 min后加入含血清的培养基终止消化，离心5 min(1 000 r/min)，将上清液吸去之后再向其中加入0.2%Ⅱ型胶原酶约2 mL，用移液管将沉淀吹散，放置于细胞培养箱中消化60 min，离心5 min(1 000 r/min)，得到沉降细胞，然后将含体积分数10%血清的细胞培养基加入管里后吹打均匀，调整细胞浓度为1×105，在新的培养皿中开始培养。

　　置于37 ℃恒温，体积分数5%CO2，饱和湿度培养箱内培养。对通过以上培养技术得到的髁状突软骨细胞进行体外鉴定(甲苯胺蓝染色)，并通过细胞形态观察、细胞生长曲线描记、计算细胞倍增时间等对所培养细胞的生物学特性进行研究。

　　应力加载装置：多通道细胞应力加载装置采用1个真空泵抽吸由特制弹性硅胶膜制成的培养皿底部，形成负压使培养皿底部产生拉伸变形，从而使附底生长的细胞受机械牵张，细胞所受力值大小以培养皿底部硅胶膜拉伸形变率(%)表示，形变率越大，表示细胞所受张力越大。

　　周期性张应力加载：在细胞培养至第3代时，调整细胞浓度为2×108L-1，并使之同步化生长后转移至6孔BioFlex 特制细胞培养皿中继续培养48 h待用。将待测细胞置于多通道细胞应力加载系统内，施加10%形变率、6循环/min的周期性张应力，每一循环包括3 s拉伸/3 s松弛；设置相应的不加力对照组。分别在0，1，6，12和24 h时收集细胞，检测细胞的增殖情况。

　　流式细胞术测定髁状突软骨细胞增殖活性的变化：

　　加载应力完毕后，立刻收集髁状突软骨细胞于15 mL离心管中，同时收集相应对照组细胞。置于离心机内1 000 r/min离心5 min，弃上清，然后加入预冷的PBS 5 mL，反复吹打，再以1 000 r/min 离心5 min，弃上清，反复冲洗3次，用4 ℃体积分数75%乙醇2 mL固定髁状突软骨细胞，将制备好的髁状突软骨细胞悬液置于4 ℃冰箱过夜。上流式细胞仪检测前，将固定好的细胞悬液，以1 500 r /min 离心5 min，弃上清，加入DNA-Prep LPR固定液100 μL，混匀10 s，再加入DNA-Prep Stain染料1 mL，混匀后室温避光15 min，上机检测S期细胞比率。

　　MTT法检测应力加载对髁状突软骨细胞增殖的影响：在收集细胞前4 h每孔加入5 g/L的MTT 200 μL，各组取5孔细胞。

　　加力结束时，吸除各孔内液体，每孔再加入DMSO1.5 mL，摇床振荡至染色颗粒完全溶解，使用加样枪吸取液体至96孔板，每孔200 μL，以不含细胞的无血清RPMI-1640培养液作为空白调零孔，上全自动酶标仪，492 nm测定吸光度值(A)。

　　主要观察指标：检测S期细胞比率和髁状突软骨细胞增殖A值，定量检测加载应力后细胞出现的变化。

　　统计学分析：本文作者应用SPSS 10.0软件对实验获得的S期细胞比率和A值数据进行采用单因素方差分析，计量资料以x_±s表示，P < 0.05为差异有显着性意义。

　　2 结果 Results

　　2.1 兔髁状突软骨细胞的生长状态 原代培养的髁状突软骨细胞24 h内可完全贴壁，细胞形态不规则，三角形、多角形均存在。原代培养的软骨细胞7 d可铺满整个培养瓶底，形成单层，软骨细胞在部分区域簇集成团，呈集落样生长。传代培养的软骨细胞一般36 h内可完全贴壁，一般5 d可形成单层。随传代次数增加，细胞中梭形细胞增多，软骨细胞分泌和增殖能力下降，传代周期延长(图1A，B)。【图1.略】

　　2.2 兔髁状突软骨细胞的甲苯胺蓝染色结果 原代培养的髁状突软骨细胞培养7 d后，甲苯胺蓝染色见单层生长区域的细胞正染成浅蓝色，有二至三个核仁，核仁呈深蓝色，集落样生长和多层生长区的中心部位细胞及细胞外基质异染成紫红色，细胞核正染成深蓝色，而其他边缘部位异染不及中心区域(图1C)。

　　2.3 兔髁状突软骨细胞的透射电镜观察结果 可见培养的软骨细胞结构正常细胞核为球形，椭圆形，核形态不规则，核仁边集，常染色质明显，可见核小体，细胞内有大量粗面内质网，线粒体及分泌小泡(图2A)。

　　2.4 兔髁状突软骨细胞S期细胞比率 流式细胞术结果显示，10%形变率、6循环/min的周期性牵张力加载于细胞6 h和12 h后，细胞S期细胞比率开始增加，差异有显着性意义(P < 0.05)；应力加载24 h后，细胞S期细胞比率增加为实验时间内最高值，差异有显着性意义(P < 0.01)。随着应力加载时间的延长，加力组的S期细胞比率出现逐渐增高的变化，提示10%形变率、6循环/min的周期性牵张力在24 h内能够促进髁状突软骨细胞的增殖活性(表1)。【表1】

　　2.5 MTT染色结果 在10%形变率、频率6循环/min的周期性张应力作用下，髁状突软骨细胞在加力1，6，12和24 h，与相应对照组比较均有细胞数量上的增加，其中加力24 h时细胞数量增加明显，与对照组比较差异有显着性意义(P < 0.01)，见表2。【表2】

　　MTT染色结果显示，髁状突软骨细胞内形成蓝紫色结晶，加力1，6和12 h组细胞内呈现蓝紫色颗粒状物，结晶物较少；加力组在24 h时间点，细胞内呈现大量松枝状的蓝紫色结晶物，细胞增殖活性增强(图2B，C)。【图2.略】
　　
　　3 讨论 Discussion
　　
　　在临床对下颌后缩病例矫正时，常采用功能矫正器，如Activator等对下颌生长进行刺激，促进下颌髁状突软骨区增生改建。通过矫正器持续的对下颌施加前伸力，颞下颌关节韧带对髁状突软骨牵张加力，改变软骨内细胞的受力环境，通过一系列细胞因子的调节，促进软骨区细胞分化、增生、改建，进而形成新的骨组织，促进下颌升枝在长度和高度方向的增加。Pancherz等曾用头影测量技术分析了98例经Herbst治疗的Ⅱ类患者，经六至七个月的治疗，有效的髁状突生长为水平向后，增长量是对照组的3倍，髁状突的生长引起颏部向前旋转，这一改变是对照组的5倍。

　　Ruf等利用MRI技术，观察治疗前后髁状突，关节窝的改建过程，发现在髁状突后上区有一信号增强的清晰带，说明该区细胞增生活跃，有新的软骨组织形成。Ng、Ma、Thieme等在各自动物实验中，通过对经功能矫正器治疗的动物进行解剖，发现在髁状突软骨中细胞细胞各种促生长因子表达增加，细胞分化明显，增生活跃。体内实验提示功能矫正与髁突软骨增生之间存在一定的作用关系，但机械力学与细胞生长调控之间的转换机制仍处于研究之中。将作用力直接加载至细胞，观察细胞生长变化成为现在研究机械力学与细胞生长调控之间的转换机制的有效方法。

　　多通道细胞应力加载系统符合体外细胞应力加载的要求，操作方便，性能可靠，可长时间稳定运行，已在多种细胞体外加力实验中得到应用。本实验中应用多通道细胞应力加载系统模拟髁状突软骨细胞在体内受到功能矫正器作用力的状态，随下颌的前伸后退产生加力、松弛的循环。

　　髁状突软骨细胞通过对应力的感应，激活细胞复杂的信号传导通路，如Ihh-PTHrP信号传导通路、骨形态发生蛋白信号等，使得细胞代谢活跃，促进了细胞的增殖。通过流式细胞术对细胞周期的分布状态进行分析以及应用MTT法检测活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶对细胞增殖进行定量研究均显示周期性的张应力对于髁状突软骨细胞增殖具有明显的促进作用，加力组与对照组在6 h后差异均有显着性意义。

　　本实验结果显示周期性应力可在24 h内不断促进髁状突软骨细胞增殖，在24 h达到试验时间内的最大值，与白明海等利用持续张应力刺激软骨细胞得到的结论：在10 h达到增殖最高峰，12 h开始下降有所不同。因加力方式不同造成的结论不同说明周期性的张应力更适合于髁状突软骨细胞生长，能够更加有效的改善下颌生长，促进下颌后缩矫正。实验结果对髁突软骨适应性改建的分子机制提供一定的实验参考，但具体改建机制及信号传导机制尚待深入研究。