微环境诱导iPSC向神经元样细胞分化的能力(2),细胞生物学论文

　　1. 2. 5 免疫细胞化学染色观察 iPSC 向神经元样细胞的分化为分析 iPSC 向神经元样细胞分化的过程，我们分别选用神经干细胞标志物 nestin,成熟神经元标志物 MAP2,利用免疫荧光染色技术，在共聚焦显微镜下进行观察并分析。具体过程如下：细胞用 40 g/L 多聚甲醛（0. 1 mol/L 的 PBS 配制）固定15 min; 用0. 01 mol/L 的 PBS 冲洗5 min ×3 次，分别加入兔抗 nestin 抗体（1∶500）或小鼠抗 MAP2 抗体（1∶600），4℃孵育过夜； 0.01 mol/L 的 PBS 冲洗5 min ×3 次，加入 Alexa Fluor568标记的山羊抗小鼠 IgG（1∶600）或 Alexa Fluor488 标记的山羊抗兔 IgG（1∶300），室温下避光孵育 3 h,0. 01 mol/L 的 PBS洗涤 5 min ×3 次； 50 mg/L DAPI（1∶200）染核，室温孵育细胞30 min,0. 01 mol / L 的 PBS 洗涤 5 min × 3 次，封片后，激光共聚焦显微镜（Olympus,FV1200 ）下进行观察。

　　1. 2. 6 Western blot 法检测 iPSC 诱导后 nestin、MAP2、GFAP的表达不同微环境诱导 iPSC 分化培养 2 周后，收集细胞，RIPA 裂解液裂解细胞，蛋白定量后，进行电泳、电转印，封闭 2 h; 分别加入兔抗 nestin 多克隆抗体（1∶2000）、小鼠抗MAP2 mAb （1∶1000）、兔抗 GFAP 多克隆抗体（1∶5000），4℃ 孵育过夜；次日分别经 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 或 HRP标记的山羊抗小鼠 IgG （1∶1000），室温孵育 2 h; ECL 发光试剂盒进行化学发光反应 2 ~5 min,随后在 Bio-Rad 化学发光成像系统下拍照并分析。利用Image J 对Western blot 印迹阳性条带进行吸光度（A）值测定，并将阳性条带与内参A 值的比值作为阳性条带的相对表达量。

　　1. 2. 7 统计学分析各指标采用 SPSS13. 0 统计软件包分析，同一指标组间比较采用单因素方差分析（ One-wayANOVA），两两比较用 LSD 检验。P < 0. 05 表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2. 1 不同微环境诱导小鼠 iPSC 向神经元样细胞分化

　　iPSC 在饲养层细胞上呈典型的克隆状生长，克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰，增殖迅速，6 ~7 d 即可进行传代（图 1A）。经胰蛋白酶消化为单细胞后的iPSC,去除 rmLIF 及饲养层细胞后，悬浮培养 3 ~ 4 d可聚集生长形成 EB.ATRA 组加入诱导剂 ATRA 后，48 h 后胚体周围边界有分化的细胞伸出，胚体边界开始毛糙，悬浮培养3 d后撤去 ATRA,在6 孔板中贴壁培养，每孔一般 12 ~ 16 个 EB 细胞团。贴壁培养1 d 后，即可观察到有少量突起从克隆团周围长出，20 d 时突起的末端伸出类似神经元的轴突和树突，并连接成网状结构（图 1B）；脑片与 iPSC 共培养组，已形成 EB 的 iPSC 悬液滴加到脑片上，在海马脑片微环境的诱导下共培养 1 d 后，克隆团周边开始长出突起样结构，20 d 时突起增多，但突起不如 ATRA 组长（图 1C）；脑匀浆上清组加入脑匀浆上清培养基后，36 h 后胚体周围边界有分化的细胞伸出，贴壁培养 2 ~3 d 后，观察到突起从克隆团四周长出，在分化的第 20 天时，有些细胞类似双极神经元和锥体神经元的形态，突起的数量和长度稳定，并互相形成网络（图 1D）。

　　2. 2 小鼠 iPSC 向神经元样细胞分化的过程及形态特征

　　为证明 iPSC 是否能分化成神经元样细胞，我们利用免疫荧光双标记的方法继续进行研究。免疫荧光染色结果显示，ATRA 组：将 ATRA 诱导3 d后的EB 贴壁培养的第 1 天计为 0 d（ Day 0,D0），在贴壁培养的第 20 天，可以观察到 Nestin 阳性的神经纤维状突起围绕在克隆团周围呈放射状生长（图 2A、C），克隆团内部的细胞大量分化为神经细胞，并且伸出细长突起的细胞显示出神经元的标志物 MAP2 阳性（图 2B、C）。脑片与 iPSC 共培养组： iPSC 与脑片共培养 20 d,可观察到克隆团内部大量细胞分化为nestin 阳性细胞（图 2D、E、F） .脑匀浆上清组：贴壁培养20 d 时，nestin 阳性的神经纤维状突起围绕在克隆团周围呈放射状生长（图 2G、I），同时见大量MAP2 阳性的神经纤维缠绕在克隆团上，并向周围放射状生长（图 2H、I）。

　　2. 3 iPSC 诱导后 nestin、MAP2 和 GFAP 蛋白的表达

　　Western blot 法检测诱导后 iPSC nestin、MAP2 和GFAP 蛋白的表达，GAPDH 作为内参。结果显示，与脑片共培养组和脑匀浆上清诱导组相比，ATRA 组的 nestin、MAP2 和 GFAP 蛋白相对表达量明显增高（P < 0. 05,图 3），但脑片共培养组和脑匀浆上清诱导组间无明显差异（图 3）。

　　3 讨论

　　与 ES 细胞相比，iPSC 无道德伦理争议，且来源广泛，避免了免疫排斥反应，在再生医学中具有巨大的应用潜力[3 - 6].干细胞的分化和发育受多种因素的调控[7].iPSC 在体外特定因子的诱导下，可以成功分化为 3 个胚层来源的各种细胞类型[8 - 14].目前，体外已成功将 iPSC 定向诱导分化为神经干细胞、运动神经元等特化细胞。因此，iPSC 有望成为干细胞移植治疗神经系统损伤的理想种子细胞来源。

　　为阐明 iPSC 在脑组织中是否能向神经元样细胞分化，我们用脑片共培养和脑匀浆上清作为条件培养液，观察脑微环境对 iPSC 的神经诱导作用。脑组织匀浆液中含多种生长因子、神经递质及神经营养因子等活性物质，如 bFGF 因子、脑源性神经生长因子等，它们通过独自或相互作用刺激干细胞向神经样细胞分化[15 -16].干细胞、胚胎干细胞等在脑组织匀浆及脊髓匀浆上清中模拟内环境，向神经方向分化的研究多有报道[17 -18].器官型脑片培养，既维持了组织或器官的内环境，又能保留组织结构，它既满足体外培养实验条件易于控制、实验过程易于观察的要求，又具备了与体内组织结构和环境更贴近的优势，是一个进行中枢再生与修复研究的理想模型[19 -20].iPSC 能否在脑片和脑匀浆上清微环境中向神经样细胞分化，还未见报道。维甲酸（ retinoicacid,RA）是目前公认的一种强烈的神经分化诱导剂[21].目前应用 ATRA 诱导胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化研究较多[22 -24].

　　本研究观察到iPSC去除饲养层细胞后，悬浮培养 3 ~4 d 可聚集生长形成 EB.ATRA 组加入诱导剂 ATRA 后，悬浮培养 3 d 后撤去 ATRA,贴壁培养1 d 后，即可观察到有少量突起从克隆团周围长出，20 d 时突起的末端伸出类似神经元的轴突和树突，并连接成网状结构；脑片与 iPSC 共培养组，已形成EB 的 iPSC 悬液滴加到脑片上，在海马脑片微环境的诱导下共培养 1 d 后，克隆团周边开始长出突起样结构，20 d 时突起增多；加入脑匀浆上清培养基 36 h后，胚体周围边界有分化的细胞伸出，贴壁培养2 ~ 3 d 后，观察到突起从克隆团四周长出，在分化的第 20 天时，有些细胞类似双极神经元和锥体神经元的形态，突起的数量和长度稳定，并互相形成网络。

　　Nestin、MAP2 是神经元的特异性标志物，GFAP 是神经胶质细胞的特异性标志物。本研究结果显示，与脑片共培养组和脑匀浆上清诱导组相比，ATRA 组的nestin、MAP2 和 GFAP 蛋白相对表达量明显增高，但脑片共培养组和脑匀浆上清诱导组间无明显差异，提示小鼠 iPSC 在脑片和脑组织匀浆上清微环境诱导后，有向神经元样细胞分化的改变。

　　综上所述，本研究结果表明：小鼠 iPSC 能够在脑片微环境和脑匀浆上清的诱导下有效的向神经元样细胞分化，并且有分化成功能性的神经元与胶质细胞的迹象，但脑片微环境和脑匀浆上清诱导效率还是低于化学诱导剂 ATRA.