绿原酸鉴定及检测方法建立

　　第二章 试验研究

　　2.1 绿原酸的鉴定及检测方法建立

　　2.1.1 试验材料

　　见附录表 2.36，2.37。

　　2.1.2 试验方法

　　2.1.2.1 绿原酸提取液的制备

　　称取杜仲叶粉末若干份，每份 0.5g 于 20mL 试管中，加入 9mLpH 值为 4，体积分数为 30%的乙醇溶液，室温避光浸泡 1.5h，置于 70℃水浴锅中提取 0.5h 后过滤、滤液离心，30%乙醇溶液定容到 10mL 贮藏备用。

　　2.1.2.2 对照品溶液配制

　　称取绿原酸对照品适量，加入体积分数 30%乙醇溶液溶解。得浓度为 1mg /mL 的绿原酸对照液，低温避光条件下密闭贮藏备用。

　　2.1.2.3 绿原酸鉴定试验

　　展开剂由三种试剂构成，取醋酸丁酯、甲酸和水以 7:2.5:2.5 比例混合均匀，置于分液漏斗中，静置，待其完全分层后，弃掉下层浑浊溶液层，将上层澄清溶液倒入 20×10cm的展开缸，密封待用。用毛细点样管吸取提取液 10-20μl，标准对照品溶液 10μl，采用少量多次点样原则，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，在展开缸内预展开半小时，放入展开剂中展开，当展开剂距薄层板顶端约 3 厘米时，取出，用吹风机吹干，置紫外光灯（365nm）下检视。

　　2.1.2.4 UV 法线性关系和线性范围考察

　　准确称取绿原酸标准品适量，用 30%乙醇溶解后配制成每毫升含绿原酸 5，10，15，20，30，40?g 的标准溶液，以重蒸水做参比。分别置于 328nm 处测定吸收值，以紫外分光光度计所显示的吸光度(A)为横坐标，以绿原酸实际浓度（μg/mL）为纵坐标，绘制绿原酸的标准曲线。

　　2.1.2.5 UV 法方法学考察

　　（1）精密度试验

　　取供试品试液一定体积，调整好仪器，将其放在 328nm 处进行连续测量，计算 5 次测得结果的吸光度值，并将数据带入标准方程，计算绿原酸浓度及相对标准偏差 RSD。

　　（2）重复性试验

　　精密量取同批待测药液 5 份，在 328nm 处测吸光值，计算出绿原酸浓度及相对标准偏差 RSD。

　　（3）稳定性试验

　　取供试品药液适量，于 328 nm 处每隔 2 小时取样一次，测定其在 12 小时内的吸光值变化，得到绿原酸浓度变化数据及其相对标准偏差 RSD。

　　（4）加样回收率试验

　　采用加样回收法。取同批杜仲叶提取药液 5 分，同一操作条件下，分别加入一定体积，已知浓度的绿原酸对照品。然后开始检测样品吸光度，根据所得数据，按回收率计算方法，计算最终结果。得绿原酸平均收率及 RSD。

　　2.1.2.6 HPLC 法色谱条件

　　色谱柱：Sepax Bio-C18，250 毫米×4.5 毫米 ID，5 微米（美国 Sepax 公司）；流动相：88%A（磷酸缓冲液，0.03mol·L-1，pH=4.71），12%B（乙腈）；流速：1.00 mL·min-1；柱温：28℃；UV 检测波长：328nm；进样量：15μL。

　　2.1.2.7 HPLC 法标准曲线绘制

　　标准梯度液配制同 UV 法，进样量 15μL。在 328nm 处测定绿原酸峰面积，以其面积(S)为横坐标，以绿原酸含量(μg)为纵坐标，绘制标准曲线。

　　2.1.2.8 HPLC 法方法学考察

　　（1）精密度试验

　　取制备好的绿原酸提取液 15μL，连续进样 5 次，测得积分面积，计算精密度试验的相对标准偏差 RSD。

　　（2）重复性试验

　　分别精密称取同一批次的绿原酸提取液 5 份，用微量进样器精密吸取 15μL，记录绿原酸所显示的峰面积，计算结果的 RSD。

　　（3）稳定性试验

　　取供试品溶液，取样时间同 UV 法。记录各时间绿原酸峰面积，并对其 RSD 值进行计算。

　　（4）加样回收率试验

　　取适量已知绿原酸含量的同批样品 5 份，各自加入一定量对照品，依法操作测定。计算目标物质平均回收率及 RSD。

　　2.1.3 结果与分析

　　2.1.3.1 绿原酸鉴定结果

　　

　　由图可知，在薄层色谱图同一水平线上，出现一排整齐的最亮的整荧光斑点，由对照品斑点位置判断出，样品中存在绿原酸。

　　2.1.3.2 UV 法标准曲线绘制结果

　　

　　由图可知绿原酸标准曲线方程为： y=22.6442x-0.2039 相关系数 r=0.9999（n=6）。其中 y 为绿原酸浓度（μg/mL），x 为吸光度值。说明绿原酸在 5~40μg/mL 区域内，线性关系很好。

　　2.1.3.3 UV 法方法学考察结果

　　（1）精密度试验结果

　

　　从表中可以看出，此方法测定绿原酸含量， RSD=1.37％，重复性较好。

　　（3）稳定性试验结果

　

　　从表中可以看出，此方法测杜仲叶绿原酸含量，相对标准偏差 RSD=1.37％，说明提取液 12h 内较稳定。

　　（4）加样回收率试验结果

　　

　　从表中可以看出，在已知绿原酸浓度的样品中加入一定浓度的绿原酸标准溶液，此方法检测绿原酸，平均回收率为 101.29%，相对标准偏差 RSD=1.25％，说明此方法来分析测定绿原酸含量是可行的。

　　2.1.3.4 HPLC 法标准曲线绘制结果

　　

　　由图可以直观看到，绿原酸标准曲线公式为： y=0.001x+0.0022 ，r=0.999（n=6）。其中 x 为绿原酸峰面积，y 为绿原酸含量（μg）。绿原酸含量在 0.075~0.6μg 区域内，此曲线的线性关系良好。

　　2.1.3.5 HPLC 法方法学考察结果

　　（1）精密度试验结果

　　

　　由上表可知，提取液中绿原酸积分面积的 RSD=0.47％，符合分析检测要求。

　　（2）重复性试验结果

　

　　结果表明，HPLC 法重复性好。
　　
　　（3）稳定性试验结果

　　

　　（4）加样回收率试验结果

　　取样方法，同 UV 法。分别加入浓度为 162μg/mL 的绿原酸标准溶液，按样品提取方法，制备处理待测药液，在同一色谱条件下，计算绿原酸含量、加样回收率及 RSD，结果如下：

　

　　由表可知，绿原酸的平均回收率为 101.39%，RSD=1.14%，绿原酸回收率较好，符合检测要求。

　　2.1.4 讨论

　　紫外分光光度法检测杜仲叶绿原酸提取液，虽然方法学考察表现出良好的精密度，重复性和加样回收率，但与高效液相检测结果还存在差异。高效液相色谱法对杜仲叶提取液中绿原酸进行定量，方法学考察的结果很好。但是，高效液相色谱设备，价格比较昂贵，对操作人员技术要求也比较高，所以一般实验室很难普及。

　　2.1.5 小结

　　通过薄层色谱法对药材提取液中绿原酸成分进行鉴定，所得薄层色谱图证明了提取液中存在绿原酸。

　　通过方法学考察，包括精密度试验、稳定性试验、重复性试验和加样回收率试验可知，UV 法可以对杜仲叶提取液中绿原酸进行初步定量，HPLC 法以对杜仲叶提取液中绿原酸进行精密定量。