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绿原酸鉴定及检测方法建立

来源:学术堂 作者:姚老师
发布于:2015-02-11 共2327字
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  第二章 试验研究

  2.1 绿原酸的鉴定及检测方法建立

  2.1.1 试验材料

  见附录表 2.36,2.37。

  2.1.2 试验方法

  2.1.2.1 绿原酸提取液的制备

  称取杜仲叶粉末若干份,每份 0.5g 于 20mL 试管中,加入 9mLpH 值为 4,体积分数为 30%的乙醇溶液,室温避光浸泡 1.5h,置于 70℃水浴锅中提取 0.5h 后过滤、滤液离心,30%乙醇溶液定容到 10mL 贮藏备用。

  2.1.2.2 对照品溶液配制

  称取绿原酸对照品适量,加入体积分数 30%乙醇溶液溶解。得浓度为 1mg /mL 的绿原酸对照液,低温避光条件下密闭贮藏备用。

  2.1.2.3 绿原酸鉴定试验

  展开剂由三种试剂构成,取醋酸丁酯、甲酸和水以 7:2.5:2.5 比例混合均匀,置于分液漏斗中,静置,待其完全分层后,弃掉下层浑浊溶液层,将上层澄清溶液倒入 20×10cm的展开缸,密封待用。用毛细点样管吸取提取液 10-20μl,标准对照品溶液 10μl,采用少量多次点样原则,分别点于同一硅胶 G 薄层板上,在展开缸内预展开半小时,放入展开剂中展开,当展开剂距薄层板顶端约 3 厘米时,取出,用吹风机吹干,置紫外光灯(365nm)下检视。

  2.1.2.4 UV 法线性关系和线性范围考察

  准确称取绿原酸标准品适量,用 30%乙醇溶解后配制成每毫升含绿原酸 5,10,15,20,30,40?g 的标准溶液,以重蒸水做参比。分别置于 328nm 处测定吸收值,以紫外分光光度计所显示的吸光度(A)为横坐标,以绿原酸实际浓度(μg/mL)为纵坐标,绘制绿原酸的标准曲线。

  2.1.2.5 UV 法方法学考察

  (1)精密度试验

  取供试品试液一定体积,调整好仪器,将其放在 328nm 处进行连续测量,计算 5 次测得结果的吸光度值,并将数据带入标准方程,计算绿原酸浓度及相对标准偏差 RSD。

  (2)重复性试验

  精密量取同批待测药液 5 份,在 328nm 处测吸光值,计算出绿原酸浓度及相对标准偏差 RSD。

  (3)稳定性试验

  取供试品药液适量,于 328 nm 处每隔 2 小时取样一次,测定其在 12 小时内的吸光值变化,得到绿原酸浓度变化数据及其相对标准偏差 RSD。

  (4)加样回收率试验

  采用加样回收法。取同批杜仲叶提取药液 5 分,同一操作条件下,分别加入一定体积,已知浓度的绿原酸对照品。然后开始检测样品吸光度,根据所得数据,按回收率计算方法,计算最终结果。得绿原酸平均收率及 RSD。

  2.1.2.6 HPLC 法色谱条件

  色谱柱:Sepax Bio-C18,250 毫米×4.5 毫米 ID,5 微米(美国 Sepax 公司);流动相:88%A(磷酸缓冲液,0.03mol·L-1,pH=4.71),12%B(乙腈);流速:1.00 mL·min-1;柱温:28℃;UV 检测波长:328nm;进样量:15μL。

  2.1.2.7 HPLC 法标准曲线绘制

  标准梯度液配制同 UV 法,进样量 15μL。在 328nm 处测定绿原酸峰面积,以其面积(S)为横坐标,以绿原酸含量(μg)为纵坐标,绘制标准曲线。

  2.1.2.8 HPLC 法方法学考察

  (1)精密度试验

  取制备好的绿原酸提取液 15μL,连续进样 5 次,测得积分面积,计算精密度试验的相对标准偏差 RSD。

  (2)重复性试验

  分别精密称取同一批次的绿原酸提取液 5 份,用微量进样器精密吸取 15μL,记录绿原酸所显示的峰面积,计算结果的 RSD。

  (3)稳定性试验

  取供试品溶液,取样时间同 UV 法。记录各时间绿原酸峰面积,并对其 RSD 值进行计算。

  (4)加样回收率试验

  取适量已知绿原酸含量的同批样品 5 份,各自加入一定量对照品,依法操作测定。计算目标物质平均回收率及 RSD。

  2.1.3 结果与分析

  2.1.3.1 绿原酸鉴定结果

  论文摘要

  由图可知,在薄层色谱图同一水平线上,出现一排整齐的最亮的整荧光斑点,由对照品斑点位置判断出,样品中存在绿原酸。

  2.1.3.2 UV 法标准曲线绘制结果

  论文摘要

  由图可知绿原酸标准曲线方程为: y=22.6442x-0.2039 相关系数 r=0.9999(n=6)。其中 y 为绿原酸浓度(μg/mL),x 为吸光度值。说明绿原酸在 5~40μg/mL 区域内,线性关系很好。

  2.1.3.3 UV 法方法学考察结果

  (1)精密度试验结果

 论文摘要

  从表中可以看出,此方法测定绿原酸含量, RSD=1.37%,重复性较好。

  (3)稳定性试验结果

 论文摘要

  从表中可以看出,此方法测杜仲叶绿原酸含量,相对标准偏差 RSD=1.37%,说明提取液 12h 内较稳定。

  (4)加样回收率试验结果

  论文摘要

  从表中可以看出,在已知绿原酸浓度的样品中加入一定浓度的绿原酸标准溶液,此方法检测绿原酸,平均回收率为 101.29%,相对标准偏差 RSD=1.25%,说明此方法来分析测定绿原酸含量是可行的。

  2.1.3.4 HPLC 法标准曲线绘制结果

  论文摘要

  由图可以直观看到,绿原酸标准曲线公式为: y=0.001x+0.0022 ,r=0.999(n=6)。其中 x 为绿原酸峰面积,y 为绿原酸含量(μg)。绿原酸含量在 0.075~0.6μg 区域内,此曲线的线性关系良好。

  2.1.3.5 HPLC 法方法学考察结果

  (1)精密度试验结果

  论文摘要

  由上表可知,提取液中绿原酸积分面积的 RSD=0.47%,符合分析检测要求。

  (2)重复性试验结果

 论文摘要

  结果表明,HPLC 法重复性好。
  
  (3)稳定性试验结果

  论文摘要

  (4)加样回收率试验结果

  取样方法,同 UV 法。分别加入浓度为 162μg/mL 的绿原酸标准溶液,按样品提取方法,制备处理待测药液,在同一色谱条件下,计算绿原酸含量、加样回收率及 RSD,结果如下:

 论文摘要

  由表可知,绿原酸的平均回收率为 101.39%,RSD=1.14%,绿原酸回收率较好,符合检测要求。

  2.1.4 讨论

  紫外分光光度法检测杜仲叶绿原酸提取液,虽然方法学考察表现出良好的精密度,重复性和加样回收率,但与高效液相检测结果还存在差异。高效液相色谱法对杜仲叶提取液中绿原酸进行定量,方法学考察的结果很好。但是,高效液相色谱设备,价格比较昂贵,对操作人员技术要求也比较高,所以一般实验室很难普及。

  2.1.5 小结

  通过薄层色谱法对药材提取液中绿原酸成分进行鉴定,所得薄层色谱图证明了提取液中存在绿原酸。

  通过方法学考察,包括精密度试验、稳定性试验、重复性试验和加样回收率试验可知,UV 法可以对杜仲叶提取液中绿原酸进行初步定量,HPLC 法以对杜仲叶提取液中绿原酸进行精密定量。

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