绿原酸植物与绿原酸合成简介

　　1.2 绿原酸简介

　　1.2.1 绿原酸植物分布、合成及代谢

　　1.2.1.1 绿原酸的植物分布

　　绿原酸在植物中分布广泛，主要存在于植物的根茎、叶、花、果实或全草中；杜仲科植物杜仲的皮、叶以及旋花科植物红薯的叶；忍冬科植物如忍冬的干燥花蕾、蒴翟的全草中均有分布；此外，绿原酸还在水果(如梨、苹果、葡萄)、蔬菜(如土豆)、小麦等中有分布[53,54]。尽管绿原酸在植物界比较常见，但含量高的植物不多见，主要有杜仲、金银花等。

　　目前植物中绿原酸的主要来源为杜仲叶和金银花，且二者绿原酸含量相当。而金银花的价格是杜仲叶的 20-30 倍。所以利用我国丰富的杜仲叶资源，对绿原酸的提取、供应有重要意义。

　　1.2.1.2 绿原酸的合成途径

　　(1)化学合成

　　据报道，绿原酸化学合成途径如图[55]：

　　（2）生物合成

　　绿原酸在植物体内，可能的生物合成路线如下[56]：

　　1.2.1.3 绿原酸的代谢

　　绿原酸在肠道和肝脏中均有代谢，实验证明[57]其主要代谢部位为肠道。根据目前研究，绿原酸进入体内，一部分以原型在胃和小肠吸收[58,59]；另一部分绿原酸进入肠道后，被肠道中的菌群和酯酶水解为咖啡酸和奎尼酸[60]。透过肠道屏障的绿原酸，咖啡酸和奎尼酸，进入肝脏后继续代谢[61]。

　　1.2.2 绿原酸的结构性质、药理作用及应用领域

　　1.2.2.1 绿原酸的结构性质

　　绿原酸是由一分子咖啡酸与一分子奎尼酸脱水缩合的产物，所以在 IUPAC 中，被命名为 3-O-咖啡酰奎尼酸，异名咖啡鞣酸，分子式为 C16H18O9，分子量 350.30。绿原酸半水合物，肉眼可见呈白或微黄色的结晶，形状如针，110℃高温下，变为无水化合物，此物质熔点为 206-208℃。绿原酸类结构式含有羟基和邻二酚羟基，属于极性有机酸，极不稳定[62]。绿原酸易溶于甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂，微溶于乙酸乙酯，难溶于三氯甲烷、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂，绿原酸在热水中溶解度高于冷水中。据此性质，可选择适当的溶剂从植物中提取绿原酸。

　　1.2.2.2 绿原酸的药理作用

　　绿原酸对某些细菌、病毒具有一定抗性：如绿原酸对奶牛乳房炎的一些致病菌具有一定抗性[63]；在体外，绿原酸对一些细菌生物膜具有抑制形成和破坏的作用，在杀菌上可与头孢他啶一同使用，起到协同作用[64]；绿原酸对早期病毒有预防作用，对猪细小病毒不但具有体外抑制作用而且还能进行体外阻断[65]；有报道称[66]，绿原酸对抗乙肝病毒，有很好的抑制作用；盛卸晃等[67]证明了绿原酸在对抗单纯疱疹病毒 I 型感染时，发挥着很好的作用，且随着绿原酸浓度的增加，这种抗病毒能力也不断增强；陈娟娟等[68]报道了绿原酸的抗人巨细胞病毒作用；绿原酸有望对抗艾滋病毒[69]。

　　绿原酸具有一定的抗肿瘤性质[70,71]，对 CT26 结肠癌移植瘤的发展起到明显的抑制[72]作用。近年来，日本研究人员发现，绿原酸具有抗突变作用，且这种作用和绿原酸浓度有关，说明绿原酸在预防癌症方面显示出重要价值。据报道[73]绿原酸作用于癌细胞上引起细胞发生核凝聚，产生的 DNA 碎片，包裹在癌细胞的外部，形成像膜一样的物质，阻止癌细胞向人体索取营养，使癌细胞与人体正常组织隔绝，抑制了变异细胞不断扩散、转移，使其在无法获得其生存所需物质，最终死亡。与此同时，绿原酸对周围正常细胞有一定的保护作用，其向周围细胞持续供应有益的营养成分，使正常细胞的自身免疫能力增强，以防止正常细胞再次病变。可见，绿原酸通过杀死病变细胞和保护正常细胞两种方法来达到抗癌作用。

　　国内外研究表明[74~76]，绿原酸是一种有效新型天然酸性抗氧化剂，具有较强的抗氧化，清除 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力。绿原酸分子结构中含有一定量的R-OH 基，所形成的羟基自由基具有很好的氧化抵抗作用，通过超氧阴离子等自由基的活性，防止组织发生氧化损伤。由于绿原酸与这些自由基发生反应，它们结合后会形成更加稳定的物质，从而清除自由基。

　　绿原酸可减少肝脏线粒体中的自由基，抑制肝脂质过氧化，起到保肝作用[77] [78]。据报道[79]，从朝鲜蓟中提取物的绿原酸可有效促进胆汁分泌，使总胆酸浓度显着增加，从而起到保肝利胆作用。

　　1.2.2.3 绿原酸的应用领域

　　随着中药领域的不断发展，越来越多的中药被《药品标准》收录。而这些中药或中成药，相当一部分的有效成分均含绿原酸，说明绿原酸在中药制剂成分中占有一席之地。目前，在银黄制剂、银黄口服液、清开灵颗粒等药品生产中，绿原酸是生产过程中质控指标之一。绿原酸作为“第七类营养素”，在保健行业大受欢迎，保健药品中添加绿原酸具有清热解毒、解除烟酒过多等功效。

　　随着人们对饮食健康的高度重视，天然的食品抗氧化剂有着广阔的发展前景，绿原酸作为食品添加剂具有增香、护色、保鲜等作用，它可取代或部分取代人工合成的食品抗氧化剂。添加了绿原酸的食品口味更加清香、颜色更加新鲜、品质更加安全可靠不易变质。

　　绿原酸具有促代谢、防衰老的功能，日本已经利用绿原酸及其衍生物抗氧化特性研制出了抗衰老护肤品。绿原酸可吸收紫外线，具有“紫外线过滤器”之称，利用其紫外吸收性质，将绿原酸添加到护肤品中，可起到防止紫外线对人体皮肤损害的作用，使肌肤舒适、自然、富有弹性。此外，以绿原酸为代表的天然物质，通过抑制酪氨酸酶和过氧化氢酶的活性，使皮肤细胞中的活性氧得以清除，从而保护胶原蛋白不受活性氧等自由基损害，达到美容的目的。含有绿原酸的化妆品具有凉血化瘀等作用，对于体内毒素引起的青春痘及各种斑点，有祛除的功效。

　　1.2.3 绿原酸的提取、分离纯化及定量方法研究

　　1.2.3.1 提取方法研究

　　(1)浸提法

　　中药浸渍提取过程大体可分为三步进行。首先，药材浸泡在溶剂中，溶剂分子在渗透压和浓度差作用下向药材内部渗透和扩散。其次，药材内部的溶质随着溶剂的进入而逐渐被溶解。 最后，被溶解的溶质向药材表面和主体溶液扩散[80]。浸提法是中药提取历史中最基础和传统的方法，至今仍在沿用。其原理是利用合适的溶剂按一定的比例或用量浸泡原药材，使目标成分溶解到溶剂中，达到提取的目的。由于绿原酸易溶于甲醇、乙醇及丙酮，极微溶于醋酸乙酯，难溶于三氯甲烷、乙醚、苯等溶剂的性质，绿原酸浸提溶剂的相关研究如下：①有机溶剂做提取液：孙利伟等[81]用超声法，对同一批杜仲分别用不同浓度甲醇、乙醇提取，实验得到 10%甲醇作提取溶剂，绿原酸产量高达 2.19%。刘海军等[82]以杜仲叶为原料，丙酮水溶液做提取溶剂，绿原酸得率为检测指标，结果表明，最佳工艺为，体积分数 40%丙酮溶液，在 65℃，料液质量体积比 1:12 时，浸提 3h，最后绿原酸得率可达 27.4%，其纯度达 77.04%。②水做提取溶剂：戚向阳、张声华等人[83]对绿原酸水提工艺研究表明：在液料比 6:1，水提温度为 40℃时，重复提取 4 次，每次 30min，最后，绿原酸浸出率的平均值可高达(94.11 土 0.53)％。

　　浸提法由于应用范围广，操作简单，是中药提取中比较常见的方法。

　　（2）超声波提取法

　　与常规提取方法相比，一方面，超声法可以实现中药低温高效萃取，对于药材中一些不耐热组分的提取具有很好应用前景。另一方面，超声波本身产生的空化效应对植物细胞具有破碎作用。所以，当中药材在不同频率超声波作用下，其组织和细胞进一步被破碎，药材与溶剂接触面积变大，目标组分更易突破植物细胞，从而提高被提化合物从药材溶出的速率。岳鹍等[84]超声法提取绿原酸时，确定了最佳条件为：体积分数 45%的乙醇溶液做提取液，料液质量体积之比为 1:8，超声 30min，此时绿原酸得率可达 2.81%。孙波等[85]超声实验表明，绿原酸的最适提取条件为：超声频率 13-26kHz，所用时间 45min，反应温度 50℃左右，液料比为 8，此条件下，纯粉中绿原酸含量提高了 30％。齐惠丽等人[86]采用超声法提取杜仲叶绿原酸，得到的最佳工艺为：60％乙醇作提取溶剂，调 pH=5，料液比l:8，提取 2 次，每次 40 min，此条件下绿原酸得率为 2.6l％。

　　超声波技术提取中药有效成分，因其具有提取率高、速度快、可避免高温提取损失中药有效成分等优点，成为近些年来中药提取研究的热点。

　　（3）微波提取法

　　一方面微波萃取能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热，另一方面微波加热利用分子极化或离子导电效应直接对物质进行加热，使细胞壁和细胞膜破碎或溶解，利于药物组分的溶出。朱亚玲等[87]分别对金银花、黄芩和芦荟等样品，在一定微波功率下处理一定时间，在扫描电镜下观察各样品细胞均有不同程度破坏。说明微波对植物细胞具有破坏作用，利用微波这一功能，可用于植物有效成分提取中。潘学军等[88]用不同方法提取甘草中甘草酸，结果得出，微波辅助提取为最适工艺。刘传斌、王威等[89]
采用微法提取红景天甙，效果较好。

　　微波提取法是近些年新发展起来的一种中药提取技术，具有简便、快速、高效、安全可靠，加热均匀等优点。

　　（4）酶法提取20 世纪 90 年代[90]出现了酶法提取中药有效成分。植物细胞壁像被子一样，将植物性中药有效成分仅仅包裹[91]，目标物质若想逃出细胞，必须克服细胞壁的阻力。而酶法提取可以迅速破坏植物细胞结构[92,93]，利于有效成分浸出，显着改善提取效果。兰小艳在前人[94,95]基础上研究单酶和复合酶，对杜仲叶角质层脱落的影响，得出最佳脱落角质层方法为：先用 pH=5.5 的果胶酶液处理 5~6 天后，再换用 pH=5.5 的复合酶液作用，目的是使角质层能完全剥落。Wurdack 等[96]阐明不同植物细胞壁结构及成分复杂，细胞壁酶解所需条件及效果也不同。植物细胞结构很特殊，其细胞外层被致密的细胞壁包裹，细胞壁是由纤维素、果胶质素等物质构成，若想使被包裹在细胞内的有效成分更好溶出，选用适当的纤维素酶、果胶酶等破坏及降解细胞壁则是一种好的方法。宋宏新[97]

　　试验结果表明，酶法提取绿原酸最佳工艺为：杜仲叶 12g，加入 10mL 2000U/mL 的纤维素酶和 10mL1200U/mL 的果胶酶，酶解温度为 50℃，酶解反应时间为 60min。王志华等[98]用纤维素酶处理葵花籽以提取其中的绿原酸，实验表明，在一定范围内，绿原酸得率与酶用量成正比，最佳酶促反应时间为lh，酶解温度为 40-50℃，果胶酶对绿原酸得率无明显影响。

　　1.2.3.2 绿原酸分离纯化研究

　　中药粗提物由于成分复杂，需要分离纯化除杂后才能得到纯度较高的产品。所以中药有效成分的分离是把控中成药生产的最关键环节，也是影响中药质量的关键问题，为解决中药杂质多、剂型大、药含量少的问题，目前已有多种中药分离手段。普通实验室，绿原酸分离纯化方法如下：溶剂萃取法是根据溶解分配定律，中药提取物待分离组分，放入两种互不相容的溶剂中，在两液交界处，药液不同成分，各自朝溶解自己的液相奔去，使目标各组分得到分离的方法。

　　膜分离法利用膜在压力或化学位差作用下，对药材提取溶液中的化学成分进行处理，以达到纯化的目的。

　　大孔吸附树脂法利用大孔吸附树脂的多孔性，具有吸附能力，在范德华引力或氢键的作用下，大孔吸附树脂对药材提取液中不同成分进行吸附。

　　絮凝澄清法是在中药提取液中加入一种能溶于水或水溶液的高分子聚合物—–絮凝剂，絮凝剂通过数量较多的活性官能团，与胶粒表面相结合；此外，絮凝剂本身拥有长链结构，当其与药材提取物中杂质胶粒接触时，二者通过静电引力、范德华力或氢键结合在一起，形成较大的絮凝物，从而发挥絮凝作用，以除去中药材提取液中大量的粗粒子。

　　1.2.3.3 绿原酸定量方法研究
　　
　　绿原酸的药理作用决定了它在医疗、保健、化妆品、日用化工，养殖等领域得到广泛应用。随着绿原酸研究的不断深入，绿原酸的检测方法也受到了人们的高度重视，其检测方法也越来越多样化。目前比较常用的方法如下：

　　紫外分光光度法是实验室最常见的检测方法，利用物质吸光性，对不同物质实现定量。

　　该法的主要依据为单色光通过待测介质后，一部分被介质吸收，使光强度降低，降低值同光束原有强度及吸收介质的厚度成正比。紫外可见分光光度法[99]具有检测设备简单，实验操作简便，检测时间较快等特点，所以是实验室应用较普遍的检测方法。

　　高效液相色谱法(HPLC)，根据样品进入色谱柱物质在不同相之间分配系数有所差异的原理，当固定相和流动相做相对运动时，被测物质便在两相间不断分配，使分配差异变大进而达到分离的目的，根据数据实现对物质定量。高效液相色谱法在杜仲叶绿原酸检测实验中[100]，体现出很好的效果。但是色谱条件的摸索较复杂，分析成本高和设备价格贵，且需要日常维护，对操作人员的技术要求也比较高，这种检测方法在实验室推广有一定的限制作用。

　　气相色谱法流动相(载气)为气体，当待测物在载气带动下通过装有填充剂的色谱柱时，测物中各组分对固定相有不同的亲和性，这样就导致了有的成分在管柱中走得快，有的速度慢。如此一来，若组分不同，则会有保留时间不同的现象发生，因而各组分得以分离。

　　气相色谱灵敏度、选择性都比较高，检测速度快，但绿原酸类化合物的气化温度高，需要进行繁琐的衍生才能检测。

　　此外，绿原酸定量方法还有差示分光光度法[101]；反相高效液相色谱[102]；协同增敏荧光光谱法[103]；高效液相色谱-蒸发光散射检测法[104]等。