泰山磐石散对PCOS妊娠大鼠血清TNF-α及妊娠结局的影响

　　多囊卵巢综合征( polycystic ovary syndrome，PCOS) 是一种以卵泡发育障碍、胰岛素抵抗和雄激素过多为其特征性改变的、病因复杂的神经内分泌疾病，育龄妇女的发生率约为 5% ～10%［1］。PCOS 患者在妊娠后极易发生自然流产。有报道，PCOS 患者在妊娠最初 3 个月内流产率高达 20% ～50%［2］。Cocksedge 等［3］在研究流产与 PCOS 的关系时发现，复发性流产者 4． 8% ～82% 存在卵巢多囊样改变，15% ～26% 存在高雄激素血症。临床资料也表明，PCOS 患者经治疗后妊娠，虽血人体绒( 毛) 膜促性腺激素( HCG) 呈进行性升高，但妊娠 6 ～ 8 周后易出现自然流产或胚胎凋萎，即使进行黄体期支持也无法改变其流产结局。PCOS 患者经促排卵治疗后，其排卵障碍可被成功纠正，但最终妊娠率低，自然流产率高。近年来，肿瘤坏死因子( TNF) 与 PCOS 的发病机制愈来愈受到关注，且 TNF －α 参与妊娠的生理及病理过程，妊娠期异常分泌的大量TNF － α 可能损害胎儿生长，引起流产和早产。而 PCOS患者体内高水平的 TNF － α 会影响妊娠的进程，导致流产和早产等危险。本实验通过脱氢表雄酮建立 PCOS 大鼠模型，研究中药泰山磐石散对 PCOS 妊娠模型大鼠血清TNF － α 及妊娠结局的影响，探讨 TNF － α 与妊娠的关系及本方改善 PCOS 妊娠结局的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1． 1 材料
　　
　　1． 1． 1 实验动物 21 日龄雌性 SD 大鼠 90 只，体质量( 60 ±15) g，购自南通大学动物实验中心，动物合格证号SCXK( 苏) 2008 － 001。饲养条件: 室内温度( 22 ± 2) ℃ ，相对湿度 50% ～70%，昼夜各 12 h 间断照明。自由摄取水和食物，饮水为自来水，普通大鼠饲料喂养，每周更换 3次垫料。实验饲料及垫料均由南通大学动物实验中心提供。

　　1． 1． 2 主要仪器 TNF － α 试剂盒、抗体均购自上海联硕生物科技有限公司; SpectraMax M2 多功能酶标仪，美国Molecular Devices Corporation( MDC) 公司产品。

　　1． 1． 3 药物及试剂 枸橼酸氯米芬胶囊( 塞浦路斯高特制药有限公司，进口药品注册证号 H20091079) ; 注射用脱氢表雄酮( 珠海远城医药化工有限公司，批号 H110312) ;地屈孕酮片( 荷兰 SolvayPharmaceuticalsB． V，国药准字H20090470) ; 泰山磐石散颗粒，药物组成: 党参 10 g，白术10 g，白芍药 12 g，熟地黄 10 g，当归 8 g，川芎 8 g，川续断15 g，黄芩 10 g，炙甘草 3 g，砂仁( 后下) 5 g，苎麻根 10 g。

　　由江苏省中医院制剂室经提取、加工、干燥成颗粒剂。

　　1． 2 实验方法
　　
　　1． 2． 1 PCOS 模型制备及分组 参照 Anderson 等［4］方法采用脱氢表雄酮建立 PCOS 大鼠模型。取21 日龄雌性 SD大鼠 90 只，分别编号，用随机数字表法分为 2 组，70 只为模型组，20 只为空白对照组。2 组大鼠均于 21 日龄断乳，适应性喂养 2 d 后，于 23 日龄( 实验第 1 d) 开始，模型组大鼠每日 8: 00 予注射用脱氢表雄酮 6 mg/100 g 体质量 +注射用大豆油 0． 2 mL 颈背部皮下注射，每日 1 次; 空白对照组大鼠予注射用大豆油 0． 2 mL 颈背部皮下注射，每日1 次，连续 30 d。模型组于注射第 20 d 时开始每日观察阴道涂片，经阴道涂片显示大鼠始终处于动情间期，无动情周期变化、无排卵。于第 30 d 模型组和空白对照组大鼠，眼眶静脉采血，模型组血清激素睾酮值升高为造模成功。

　　于 80 日龄起，模型组大鼠用枸橼酸氯米芬 10 mg/100 g体质量每日 1 次灌胃，连续 5 d 促排卵后，模型组大鼠及空白对照组大鼠与雄鼠按 1∶ 1合笼，次日以发现阴栓者记为妊娠第 1 d，并分为正常妊娠组、PCOS 妊娠空白组、PCOS妊娠中药组及 PCOS 妊娠西药组，每组各 20 只。

　　1． 2． 2 给药方法 妊娠第 1 d 开始，PCOS 中药组予泰山磐石散颗粒溶液( 即将每剂泰山磐石散颗粒加水 111 mL配制而成，含生药 0． 909 g/mL) 1 mL/100 g 体质量灌胃给药，PCOS 妊娠西药组予等容积地屈孕酮溶液( 即将地屈孕酮每片 10 mg，约加水 55 mL 配制而成，含生药 0． 18mg / mL) 灌胃，PCOS 妊娠空白组予等容积 0． 9% 氯化钠注射液灌胃。均每日 1 次，连续 5 d。正常妊娠组不进行任何干预。

　　1． 2． 3 标本采集及制备 以上各组孕鼠均于妊娠第 5 d14: 00 时各取 6 只，眼眶静脉采血，以血 1 mL∶ 肝素10 μL比例将肝素加于血内，离心，取上清，置于 － 20 ℃ 冰箱中保存待行血清 TNF － α 的测定。操作方法严格按照试剂盒说明书进行。妊娠第 8 d 16: 00 时另取各组孕鼠 6 只，脱臼处死，取双侧子宫，记录孕鼠数及胚胎着床数。

　　1． 3 统计学方法
　　
　　应用 SPSS 17． 0 统计软件进行统计学分析，计量资料采用均数 ± 标准差( x珋 ± s) 表示，组间比较采用单因素方差分析和 q 检验。

　　2 结 果

　　2． 1 2 组大鼠体质量比较 见表 1.【表1】

　　
　　由表 1 可见，造模前 2 组大鼠体质量比较差异无统计学意义( P ＞0． 05) ; 造模后模型组大鼠体质量高于空白对照组( P ＜0． 05) 。

　　2． 2 各组孕鼠血清 TNF － α 比较 见表 2。【表2】

　　由表 1 可见，PCOS 妊娠空白组血清 TNF － α 水平较正常妊娠组明显升高( P ＜0． 05) ，而 PCOS 妊娠中药组及PCOS 妊娠西药组血清 TNF － α 较 PCOS 妊娠空白组降低( P ＜0． 05) ，与正常妊娠组比较差异无统计学意义( P ＞0． 05) 。2． 2 各组孕鼠胚胎着床平均数比较 见表 3。【表3】
 

　　由表 3 可见，PCOS 妊娠空白组胚胎着床平均数少于正常妊娠组( P ＜ 0． 05) ，而 PCOS 妊娠中药组及 PCOS 西药组胚胎着床平均数较 PCOS 妊娠空白组增多 ( P ＜0． 05) ，且与正常妊娠组比较差异无统计学意义 ( P ＞0． 05) 。

　　3 讨 论

　　3． 1 TNF － α 与 PCOS TNF － α 属 TNF 家族中的一员，它具有许多重要的生物学功能，包括抗瘤、抑瘤，促进细胞生长，诱导细胞分化、凋亡，调节机体组织糖、脂肪代谢。

　　在正常情况下，血浆中有较低水平的 TNF － α，对维持机体内环境的稳定起着重要作用。高浓度的 TNF － α 抑制卵巢颗粒细胞上胰岛素生长因子 － 1( IGF － 1) 诱导的 b 合成，从而影响卵泡质量及正常发育。Wu 等［5］研究发现，在 PCOS 患者卵泡细胞中存在高水平 TNF － α 表达，且高TNF － α 和高体质量指数与低白细胞介素 6( IL － 6) mＲNA的表达存在一定的关系。Sayin 等［6］也报道，在正常体质量的 PCOS 伴高雄激素血症患者中，无论是否存在 PCOS的其他表现，均表现出明显升高的 TNF － α 水平。

　　3． 2 TNF － α 与妊娠 TNF － α 是由激活的单核 － 巨噬细胞产生和分泌的多肽类物质。研究表明，TNF － α 对胚胎着床有重要调节作用，并参与了妊娠全过程的调节作用［7］。适量分泌 TNF － α 可调节滋养层细胞的正常增殖、分化和凋亡，促进妇女能量代谢及胚胎发育，提高孕激素及人绒毛膜促性腺激素( HCG) 的合成，对妊娠的维持起着重要作用［8］。当外周血中 TNF － α 增加时，可抑制黄体功能，促进黄体退化，导致孕酮的合成下降，内分泌紊乱，最终引起流产。Arslan 等［9］研究发现，流产患者伴有血清TNF － α 的异常升高，母胎界面局部产生的 TNF － α 有94% 释放于母体外周血循环中［10］。龙凤宜等［11］发现，TNF － α 与流产的关系密切。TNF － α 主要结合在蜕膜的间质和血管内皮细胞膜上［12］，由此激活蜕膜间质中的免疫活性细胞，导致免疫排斥，产生临床上早期流产。

　　综上所述，TNF － α 作为一种具有多种生物学功能的细胞因子，参与受精、着床和妊娠的生理及病理环节，妊娠期异常分泌的大量 TNF － α 可能损害胎儿正常生长，引起流产和早产。而 PCOS 患者体内高水平的 TNF － α 无疑会影响妊娠的进程，导致流产和早产等危险。PCOS 由于自身内分泌紊乱的病理环境不利于胚胎的生长发育，即使给予调整月经周期及纠正排卵，仍存在低妊娠率、高流产率的现象。为了研究中医及西医治疗方法对 PCOS 妊娠结局的干预作用，以及 TNF － α 浓度水平与妊娠结局的相关性，以更好的指导临床，设计了本实验。

　　中医学认为，PCOS 发生不孕及流产的根本原因是肾精亏虚，冲任匮乏，气血失调; 而 PCOS 流产的发展演变过程又常与脾虚相关，因此补肾在其防治中起主导作用，而健脾起协同作用。应用泰山磐石散加减补气养血，固肾健脾安胎，对 PCOS 的不良妊娠结局有很大的扭转和改善作用。泰山磐石散出自《古今医统大全》，功能益气健脾，养血安胎，适宜气血虚弱所致的堕胎、滑胎、胎动不安，是临床常用的安胎、保胎方。方以党参、白术、炙甘草益气健脾以固胎元; 当归、川芎、白芍药、熟地黄补血养血调血以养胎元; 川续断、熟地黄、白芍药合用，益肝肾而保胎元; 砂仁调气安胎; 黄芩、白术、苎麻根健脾清热，为安胎的要药。

　　诸药合用，使气血调和，冲任得固，胎孕得安。现代药理研究亦表明，上述中药可通过调节内分泌功能而发挥安胎的作用［13］。本实验结果提示，PCOS 妊娠大鼠血清 TNF － α水平较正常妊娠大鼠偏高，泰山磐石散及西药地屈孕酮能在一定程度上降低血清 TNF － α 的水平，并能提高胚胎着床率。证实泰山磐石散及地屈孕酮能改善 PCOS 大鼠血清 TNF － α 的水平，提高妊娠率，降低流产率。本实验结果说明，血清中 TNF － α 浓度水平与妊娠结局存在一定相关性，日后有望成为预测流产的指标之一，从而为中医药改善 PCOS 妊娠结局方面提供理论和方法依据。