急性心肌梗死中报告基因示踪方法的运用

　　急性心肌梗死是指在冠状动脉病变的基础上血供急剧减少或中断，使得相应的心肌严重而持久缺血所致的急性心肌坏死。虽然冠心病的二级预防和血管再通治疗日趋成熟，急性心肌梗死及其并发症仍是现代社会人类健康的重要威胁之一。根据最新统计结果，中国心血管病 （ 冠心病、脑卒中、心功能衰竭、高血压） 患病率处于持续上升态势，死亡率亦居各死亡原因的首位[1].随着干细胞临床应用前景不断被开发，干细胞治疗急性心肌梗死逐渐成为当下医学领域的研究热点。近期一项综合了 50 个研究、2626 例患者的Meta 分析结果显示，成人骨髓细胞 （ bone marrow cell,BMC） 移植治疗可通过减少梗死面积、延缓左心室重塑和改善左心室功能而使缺血性心脏病患者获得长期受益[2].然而，另一项综合了 22 个随机对照试验的Meta 分析则认为，冠状动脉内注射骨髓源单个核细胞（ bone marrow-derived mononuclear cell,BMMNC） 并未改善急性心肌梗死患者的心功能影像学评估结果和临床预后[3].除了确切疗效的争议外，干细胞移植后的生物学行为，如： 定位、增殖、分化、迁移，治疗心肌梗死的作用机制及疗效监测等方面仍存在许多问题亟待阐明。

　　分子影像学是在活体状态下，在细胞和分子水平上应用影像学方法对人或动物体内的生物学过程进行成像，进而开展定性和定量研究的一门学科。结合各种探针标记物和现代医学成像技术，可动态、实时及在体监测移植后干细胞的归巢、转归及疗效。本文主要讨论了分子影像学方法，尤其是报告基因示踪方法应用于干细胞治疗急性心肌梗死，从而揭示干细胞移植后的生物学行为及作用机制，并推动干细胞治疗的成熟和发展。

　　直接标记与报告基因标记方法

　　构建特异性的靶向探针是分子成像的基础，如何构建靶向干细胞的特异性探针逐渐成为研究热点。目前的标记方法主要分为直接标记和间接标记两种。直接标记方法是指以特定的标记物试剂孵育培养干细胞，使分子探针经由被动扩散、主动转运或吞噬作用进入细胞内。常用的标记物包括近红外荧光染料用于荧光成像 （ fluorescence imaging,FI） ,氟 [18F] 脱氧葡萄糖 （18F-fluorodeoxyglucose,18F-FDG） 用于正电子发射断层显像 （ positron emission tomography,PET） ,锝 [99mTc] 六甲基丙二基胺肟 （ hexamethylpropyleneamine oxime,99mTc-HMPAO） 用于单光子发射计算机断层显像 （ single photon emission computed tomography,SPECT） ,超小超顺磁性纳米铁颗粒 （ ultra-small super-paramagnetic iron oxide, USPIO ） 用于磁共振成像（ magnetic resonance imaging,MRI） 等[4].直接标记方法的优点在于操作简便，可以短时间内迅速获得高效标记。其缺点则在于构建靶向探针的稳定性差，标记物可能随细胞分裂而被稀释，从而导致假阴性； 另一方面，标记物可能在细胞死亡后持续存在于细胞外基质中或被巨噬细胞吞噬，从而导致假阳性。因此，所得的影像结果并不能如实反映细胞数目和活性，该方法较适用于移植后短期的干细胞定位示踪。

　　间接标记方法主要是指标记报告基因，即将合成DNA 序列经质粒转导或病毒转染整合入干细胞基因组内，其表达的蛋白可自身成像或作用于特异的底物而发出信号。常用的标记物包括绿色荧光蛋白 （ greenfluorescent protein,GFP） 用于 FI[5],萤火虫荧光素酶Fluc 用于生物发光成像 （ bioluminescence imaging,BLI）[6],1 型单纯疱疹病毒胸苷激酶 （ herpes simplexvirus type 1 thymidine kinase,HSV1-tk） 及其突变体用于 PET 成像[7],碘化钠转运体 （ sodium iodide symport-er,NIS） 用于 SPECT 成像[8],转铁蛋白及其受体用于 MRI[9]等。由于报告基因将随着干细胞基因组的表达而表达，随着干细胞失活而失活，因此测得的信号强度可较好地反映细胞数目和活性。此外，基因的人工设计特性使其得以满足更多的个性化需求，如融合基因有助于多模态监测的同步化进行，心脏细胞特异性的启动子或剪切酶有助于判定干细胞的分化方向。

　　当然，转导或转染存在诱导干细胞基因突变的风险，其临床应用的安全性有待验证。近期已有临床试验成功地把 HSV1-tk 应用于脑胶质瘤的基因治疗及疗效评估[10],相信其在心血管病的诊断和治疗领域也将占有一席之地。

　　移植干细胞的存活、增殖、迁移及凋亡借助日新月异的分子成像方法，人们可以对移植后干细胞的生物学行为，包括定位、存活、增殖、迁移等有效地进行在体示踪。其中，细胞增殖的直接监测需要引入核苷核素标记，该方法目前尚未成熟，暂不适用活体成像[11].相对地，报告基因标记可以对干细胞进行实时监测和半定量分析，从而反映细胞的总体存活和增殖情况。Liu 等[12]用 Fluc 和 HSV1-tk 标记人心脏前体细胞 （ human cardiac progenitor cells,hCPCs） ,随后对 hCPCs 进行长达 4 周以上的示踪； 同时发现，PET 示踪的 hCPCs 早期定位、存活情况与MRI 评估的心功能长期恢复情况具有显著相关性。

　　Templin 等[13]将 NIS 转染人诱导多能干细胞 （ humaninduced pluripotent stem cells,hiPSCs） ,利用 SPECT /CT 长期示踪达 15 周以上，并以 3-D NOVA 图像直观地显示干细胞在心脏组织的分布和迁移。值得注意的是，许多研究均提示干细胞移植后的长期存活率并不理想。无论胚胎干细胞 （ embryonic stem cells,ESCs）[14]、间充质干细胞 （ mesenchymal stem cells,MSCs）[15]还是 iPSCs[16]等，细胞信号强度大多在移植后 1 周内开始随时间逐渐减弱。因此，为证实移植后干细胞是否在体内发生凋亡，现已开发出相应的凋亡探针来监测该过程。如探针 pcFluc-DEVD （ 天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸，Asp-Glu-Val-Asp） ,当凋亡级联反应启动时，caspase3 被激活，DEVD 肽链被酶解而释放活性的 Fluc,从而进行 BLI 成像[17].同样，Wang等[18]将 DEVD 插入 HSV1-tk 而制成凋亡探针，并成功地用于肿瘤细胞的化疗疗效监测。作为 PET 报告基因，HSV1-tk 相关探针无疑具有更大的临床应用价值。越来越多的研究证明，分子影像学示踪方法的成功应用使得移植后干细胞的命运不再扑朔迷离，更推动了干细胞治疗急性心肌梗死在临床领域的进程。

　　另一方面，一系列研究试图寻求最佳的治疗时机、注射途径及细胞数目等实际操作方案，以提高干细胞的存活率和治疗效果。一项 Meta 分析显示，心肌梗死后的 4 ~7 d 为注射干细胞的理想时间，鉴于该时段细胞趋化因子正处于峰值期[19]; 也有不同观点认为，应在心肌梗死发生的即时给予干细胞注射，以尽可能减少心肌细胞的丢失[20]; Swijnenburg 等[21]却发现，治疗时机对急性心肌梗死和亚急性心肌梗死模型中干细胞存活和心功能改善的影响微乎其微。关于注射途径，心肌注射虽然效果强于冠状动脉内注射，但临床上较难实现，研究数据也相对欠充分[22].关于细胞数量，CD34+BMCs[23]及其他类型干细胞均提示具有显著的剂量依赖效应[24].随着理论依据的更新、技术条件的改进和临床经验的积累，干细胞治疗急性心肌梗死正逐渐地成熟和完善，上述问题也将逐一给出合理的解答。

　　移植干细胞作用机制根据目前的研究结果，干细胞治疗急性心肌梗死的作用机制主要包括细胞分化和旁分泌作用两方面。多向分化能力是干细胞的特性之一。因此，人们猜想移植后干细胞可以定位于病灶区域并向心肌细胞分化，从而修复或替代梗死的心肌细胞。Carpenter等[24]将由 hiPSCs 衍生的心脏前体细胞 （ cardiac pro-genitor cells,CPCs） 植入心肌梗死后的大鼠心肌，发现 CPCs 可在体内向心肌细胞、血管上皮细胞及血管平滑肌细胞分化。Wang 等[25]构建干细胞特异基因C / r-Luc 融合内皮细胞特异基因 G / f-Luc,随后用其标记 hMSCs,BLI 定量分析及病理免疫组织化学结果均表明，hMSCs 在移植 2 d 后开始向血管内皮细胞分化，并逐渐成为血管网络的一部分，血管新生是心功能得以改善的重要原因。

　　然而，移植后干细胞在梗死心肌局部的定位及存活情况并不十分理想，单凭分化作用不足以解释干细胞治疗的疗效。Tongers 等[26]研究认为，BMSCs 的作用在于早期的旁分泌及免疫调节功能，干细胞本身并没有在心肌组织长期存活。同样，Fan 等研究发现，BMSCs 治疗显著抑制促凋亡基因 （ Bax、caspase-3）的表达和炎性标记物 [基质金属蛋白 （ matrix metallo-protein-9,MMP-9 ） 、氧化蛋白、CD40 + 细胞] 的产生，却有利于血管生成 [血管内皮生长因子 （ vascularendothelial growth factor,VEGF） 、CD31 + 细胞、基质细胞衍生因子 （ stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α） 、趋化因子受体 （ chemokine receptor type 4,CX-CR4） ] 和心肌保护 （ connexin43、 troponin-I、 cyto-chrome-C） 作用。Wang 等[28]对人 CD34+细胞进行多模态示踪，分别通过抗 VEGF 和抗 α4β1处理来抑制内源性内皮细胞的产生和心肌分化，结果发现前者明显不利于心功能的改善，后者却无显著影响，可见干细胞的旁分泌和促血管生成作用是其主要治疗机制，而心肌细胞分化并不占主导地位。Xiong 等[29]研究证实，人胚胎干细胞来源的血管细胞 （ human embryonicstem cell derived vascular cells,hESC-VCs） 可以旁分泌大量细胞因子，从而减少原有心肌细胞的凋亡，同时募集并活化内源性的 c-kit （ + ） 前体细胞使其发挥作用。此外，其他干细胞如皮质骨来源的干细胞[30],诱导多能干细胞及其衍生细胞[31]等均能分泌大量参与心脏修复过程的细胞因子、趋化因子或生长因子，从而起到保护原有心肌细胞、调节新血管生成、抑制梗死后炎性反应和纤维化或促进内源性干细胞募集和分化的作用。而上述研究成果的发现，均有赖于分子影像学手段的成功应用。

　　其他辅助治疗除了在干细胞本身下文章以外，各种强化辅助治疗药物开始登上舞台。基于分子影像学的研究证明，抗氧化剂[32]、免疫抑制剂[33]和生长因子[34]可通过对抗氧化应激、抑制免疫排斥反应、促进血管生成、促进干细胞分化等机制提高干细胞存活率及疗效。Zhang等[35]通过 BLI 和病理染色发现，联合瑞舒伐他汀辅助治疗可通过磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋丝氨酸苏氨酸蛋白激酶 （ phosphatidylinositol-3-kinase/protein serine threo-nine kinase,PI3K / Akt） 和分裂原细胞外激酶 / 细胞外调节蛋白激酶 1/2 （ mitogen extracellular kinase/extra-cellular regulated protein kinases 1 /2, MEK / ERK1 /2 ）信号通路提高脂肪来源间充质干细胞 （ adipose derivedmesenchymal stem cells,AD-MSCs） 移植后存活率，从而减少心肌细胞凋亡、心肌纤维化并改善心功能。类似的，Exendin-4 也可通过信号转导和转录激活因子 3（ signal transducer and activator of transcription 3,STAT3） 激活途径而强化 AD-MSCs 治疗的作用[36].

　　然而，由于半衰期较短，上述辅助药物所带来的优势并不持久。为此，研究者尝试通过基因工程的方法使得干细胞自身具备持续合成辅助因子[37]或 microR-NAs[38]的能力。

　　与此同时，亦有学者利用新型生物材料设计出具有更好生物活性以及组织兼容性的移植物复合体，如将干细胞与基底膜、纤维蛋白等细胞外基质成分混合[39],将干细胞进行微型封装以实现免疫保护同时补充血管生成所需的底物等[40].Ceccaldi 等[41]设计了一种新型 3D 支架，借此为移植后干细胞提供有效的物理支持和适宜的生长环境。此外，Wiilliams 等[42]将 hMSCs 和 c-kit （ + ） 心脏干细胞 （ cardiac stemcells,CSCs） 联合注射入猪的心肌梗死模型，发现干细胞存活率、心肌梗死面积、心肌活力及心功能均较单独注射和对照组有显著改善。可以预见，分子影像学和其他医学乃至非医学学科的密切合作，将为干细胞治疗急性心肌梗死写下新的篇章。

　　综上，干细胞治疗急性心肌梗死具有极大的临床应用价值和发展潜力。然而，在获得普遍认可和临床推广之前，移植后干细胞的生物学行为和作用机制是必须阐明的问题。借助各种分子影像学手段，特别是报告基因标记方法对干细胞进行在体示踪，人们得以监测移植后干细胞的定位、存活、增殖甚至凋亡，移植后干细胞的命运日趋明朗，其分化以及旁分泌作用亦逐渐被证实。为了进一步提高干细胞的存活率和治疗效果，各种衍生及辅助治疗方案应运而生，而其可行性和有效性的评估极大得力于分子影像学的应用。

　　随着各种标记探针和成像手段的不断发展，相信报告基因标记示踪方法以及干细胞治疗急性心肌梗死将在未来发挥更大的作用。