摘要： 目的 研究胰高血糖素样肽素-1（ glucogon like peptide-1,GLP-1） 对晚期糖基化终产物 （ advanced glycation endproducts,AGEs） 诱导 H9C2 心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法 体外培养 H9C2 细胞，实验分为 4 组： 正常对照组、100 mg· L- 1AGEs 试验组、AGEs （ 100 mg · L- 1） + GLP-1（ 10 nmol·L- 1） 组、AGEs（ 100 mg·L- 1） + NAC（ 5 mmol·L- 1） 组，处理 24 h.通过 CCK-8 比色法检测细胞存活率，相差显微镜观察细胞形态，双氯荧光素（ DCFH-DA） 染色荧光显微镜摄片观察细胞内活性氧（ ROS） 水平； RT-PCR 法测定Bax、Bcl-2 mRNA 基因的表达； 运用 Hoechst 33258 检测试剂盒及流式细胞术检测心肌细胞的凋亡率，Western blot 检测凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2 的表达量。结果 与正常组相比，100 mg·L- 1AGEs 组降低 H9C2 细胞生存率，活性氧（ ROS）生成量增加； 与 AGEs 组相比，AGEs + GLP-1 组细胞生成率提高，活性氧（ ROS） 生成量减少。与正常组相比，AGEs 组促凋亡蛋白 Bax 表达增加，抑制凋亡蛋白 Bcl-2 减少，细胞凋亡率升高； AGEs + GLP-1 组较 AGEs 组下调促凋亡蛋白 Bax,上调凋亡抑制蛋白 Bcl-2,细胞凋亡率减少。结论 GLP-1 对AGEs 诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用，其保护机制与减少活性氧（ ROS） 有关。
关键词： 胰高血糖素样肽素-1; 糖基化终产物； 活性氧；H9C2 心肌细胞； 凋亡； 心肌保护； 机制。
大量研究表明晚期糖基化终产物（ advancedglycation end proudct,AGEs） 在糖尿病心肌病的发生发展过程中发挥关键的作用[1 -2],AGEs 是机体在长期高糖状态时蛋白质和还原糖之间经过非酶性糖基化反应生成的物质； AGEs 诱导心肌氧化应激，活性氧形成，进而导致细胞损伤、甚至凋亡。因此，发现抑制 AGEs 诱导心肌氧化应激并对其损伤性小的药物尤为关键。
越来越多的研究证实，过多活性氧在心血管疾病发生发展中起到重要作用。如： 动脉粥样硬化、心力衰竭[3 -4]等。另外心力衰竭、心肌病等心血管疾病的发生、发展与心肌细胞凋亡现象有关。心肌细胞凋亡是心肌缺血损伤机制中的一个重要环节，是引发心力衰竭的重要诱因； 其中活性氧 （ ROS） 介导的氧化应激在心肌细胞凋亡的病理过程中发挥了重要的作用[5 -6].
胰高血糖素样肽-1 （ glucogen like peptide-1,GLP-1） 是机体中一种具有“肠促胰素效应”的肠源性激素，在发挥综合降糖作用外，GLP-1 对心血管系统也有保护作用； 在血管内皮细胞中 GLP-1 能降低RAGE 表达，阻断 AGEs / RAGE 轴造成的细胞损害[7 -8]; 同时发现 GLP-1 也可减少急性冠脉综合征患者心肌梗死面积[9 -10].但 GLP-1 对 AGEs 诱导的 H9C2 心肌细胞损伤的作用未见报道。本实验通过建立 AGEs 诱导 H9C2 心肌细胞损伤模型，探讨GLP-1 对 AGEs 诱导 H9C2 心肌细胞损伤性保护作用及其可能机制。为 GLP-1 临床上有效治疗糖尿病心血管并发症提供理论研究基础。
1 材料与方法。
1. 1 细胞与主要试剂 H9C2 大鼠心肌细胞株由南昌大学第二附属医院实验室细胞库惠赠。AGEs（ 121800,Calbiochem,美国） ,DMEM-F12 培养基（Hyclone 公司，美国） ,胎牛血清（ BI 公司，以色列） ,GLP-1（ Sigma 公司，美国） ,Hoechst 33258 试剂盒购自南京建成生物工程研究所，N-acety-L-cysteine（NAC） 、活性氧检测试剂盒、细胞计数 CCK-8 试剂盒均购于碧云天生物技术研究所，细胞凋亡检测试剂盒 AnnexinV-FITC/PIKit （ 北 京 庄 盟） ,兔 抗 老 鼠GAPDH（ 10494-1-AP,Peprotech 公司产品，美国 ） ,Bax、Bcl-2（ 12789-1-AP） 多克隆抗体为 Peprotech 公司产品，CDI-165M 三气细胞培养箱、BIO-BEST200E凝胶成像系统（ SIM 公司） ,TS100-F 倒置相差显微镜（ Nikon 公司，日本） ,超净工作台（ 苏州净化设备有限公司） ,冷冻高速离心机（ 珠海黑马医学仪器有限公司） ,水平电泳仪（ 北京六一仪器厂） ,PCR 仪（ BIO-RAD 公司） ,BDFACSCalibur 流式细胞仪（ BD公司，美国）。
1. 2 方法。
1. 2. 1 细胞培养与处理 H9C2 细胞培养于含体积分数为 0. 15 胎牛血清的 DMEM-F12 培养液，37 ℃ 、CO2体积分数 0. 05、饱和湿度条件下培养。细胞贴壁 80% 以上时，0. 25% 胰酶消化、计数、传代，每 3 ~4 d 传代 1 次。取接种对数生长期细胞进行实验。
1. 2. 2 CCK-8 法检测细胞成活率 取对数生长期细胞，以2 ×107·L- 1细胞浓度接种96 孔板，各实验组设 4 个复孔，另设无细胞培养液孔为空白对照。根据 CCK-8 试剂盒说明书，处理结束后每孔加入10μL CCK-8 工作液。37 ℃ 培养 2 h,酶标仪（ El ×800,BioTek,USA） 记录 450 nm 波长处的吸光度。取 4 孔光密度（ optical density,OD） 的平均值，按下列公式计算细胞存活率： 生存率/% = （ OD 处理组-OD 空白组） /（ OD 对照组 - OD 空白组） ×100% .实验重复 3 次。
1. 2. 3 细胞内 ROS 水平的测定 根据实验需要给予相应的处理： （ 1） 实验对照组； （ 2） 100 mg·L- 1AGEs 处理 24 h; （ 3） 10 nmol·L- 1GLP-1 与100 mg·L- 1AGEs 处理 24 h; （ 4） 抗氧化剂（ NAC）与100 mg·L- 1AGEs 处理 24 h.均包括 3 个复孔。处理完成后，用 PBS 漂洗 6 孔板 2 次，用 10 μmol·L- 1DCFH-DA 染液于 37 ℃ 孵育 20 min.在荧光显微镜下随机选取 5 个不重复区摄片，用 Image J1. 410 软件分析 4 个视野绿色荧光强度的平均值，再对每组的各样本进行统计分析。
1. 2. 4 Hoechst 33258 核染色法检测心肌细胞凋亡H9C2 心肌细胞经不同因素处理后，小心弃去培养基，PBS 洗 1 遍，4%多聚甲醛固定 10 min,PBS 漂洗后，加入 5 mg·L- 1Hoechst 33258 试剂，室温轻摇 30 min.在荧光显微镜 （ BX50-FLA,Olympus,Japan） 下摄片，染色质均匀分布，核被染成均匀蓝色的细胞认为是正常细胞，核呈浓缩、碎裂的明亮蓝色细胞认为是凋亡细胞，随机选取视野在荧光显微镜下摄片。
1. 2. 5 RT-PCR 检测凋亡相关基因 Bax、Bcl-2 mR-NA 的表达 将 H9C2 细胞按 1 × 106/ 孔接种于 6 孔板中，实验分组同上，刺激细胞 24h 后，按 RNA 快速提取试剂盒说明书提取各组细胞总 RNA,采用两步法 RT-PCR: 以 Olig（ dT） 为引物，以 M-MLV 反转录合成 cDNA,0. 01 琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性再行 PCR 扩增，PCR 反应体系： cDNA 0. 5 μL,上下游引物各 1 μL,Mix 12. 5 μL,ddH2O 10 μL,总体积 25μL.扩增产物采用 0. 01 琼脂糖凝胶电泳 25 ~ 30min,凝胶成像系统照相，Image J 软件进行灰度分析。如 Table1 所示：
