摘要： 目的：探究细胞焦亡在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的变化及作用机制。方法：选择成年健康雄性SD大鼠，体重210-230g.大鼠糖尿病模型采用腹腔注射1%链脲佐菌素60mg/kg制备，取造模成功的SD大鼠40只，将其随机分为2组（n=20）：糖尿病假手术组（DS组）、糖尿病心肌缺血再灌注组（DIR组）；另取非糖尿病大鼠40只，将其随机分为2组（n=20）：假手术组（NS组）、心肌缺血再灌注组（NIR组）。采用结扎左冠状动脉前降支30min再灌注120min的方法制备心肌缺血再灌注模型；NS组、DS组只穿线不结扎。再灌注结束后，采集动脉血样，检测肌酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）的活性；采用TTC法检测心肌梗死面积；HE染色观察心肌组织病理学变化；Western Blot法检测NLRP3、caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和IL-1β在心肌组织的表达。结果：DS与NS相比，NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表达增加；非糖尿病和糖尿病大鼠在心肌缺血再灌注时，CK-MB和LDH的活性增加，NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表达增加；DIR组与NIR相比，心脏病理学损伤加重，心肌梗死面积增加，CK-MB和LDH活性增高，NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表达增加。结论：糖尿病大鼠心肌对缺血再灌注敏感性增加，缺血再灌注损伤加重，其机制可能与NLRP3介导的caspase-1依赖性细胞焦亡的作用密切相关。
糖尿病合并缺血性心脏疾病患者，在经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术治疗时可导致心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤。研究表明，糖尿病患者心肌缺血再灌注损伤的发病率不仅高于非糖尿病患者，且心肌受损程度更为严重、预后更差、死亡率更高[1].糖尿病合并心肌缺血再灌注时，心肌细胞坏死和凋亡是其损伤加重和敏感性增加的重要原因[2].细胞焦亡是近年发现的一种新的促炎程序性细胞死亡方式，最主要的生物学特征是依赖于半胱天冬酶-1（caspase-1）并伴随炎症级联反应，在内源性和外源性刺激作用下，凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like proteincontaining,ASC）作用于pro-caspase-1形成炎性小体并激活pro-caspase-1,活化的caspase-1诱导下游细胞因子白细胞介素（interleukin,IL）-1β、IL-18活化，细胞释放乳酸脱氢酶（LDH）等胞内物质，介导组织细 胞 损 伤[3]. 研 究 表 明，大 鼠 糖 尿 病 心 肌 中caspase-1的mRNA水平和蛋白质的表达显着增加[4],进 一 步 研 究 发 现NLRP3炎 性 小 体 激 活caspase-1介导的细胞焦亡在糖尿病性心肌病（dia-betic cardiomyopathy,DCM）发生发展中起重要作用[5].研究发现，肾小管上皮细胞缺血再灌注时，caspase-1和IL-1β表达增加，证实细胞焦亡是肾小管上皮细胞I/R损伤的重要机制[6].然而caspase-1依赖的细胞焦亡是否参与糖尿病心肌缺血再灌注损伤，caspase-1依赖的细胞焦亡是否介导增加糖尿病心肌缺血再灌注损伤的敏感性和易损性尚未见报道。本研究拟探究caspase-1依赖的细胞焦亡在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及可能机制。
1 材料与方法。
1.1 动物及分组 SPF级健康成年雄性SD大鼠，体重210-230g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。适应性观察1周，禁食12h后经腹腔注射l%链脲佐菌素-柠檬酸盐缓冲液（Sigma公司，美国）60mg/kg,3d后禁食6h,断尾取血测空腹血糖，若血糖值>16.7mmol/L,并出现多饮、多食、多尿即糖尿病大鼠模型制备成功。此后每周测定一次空腹血糖和体重，普食饲养8周。非糖尿病大鼠腹腔注射等量柠檬酸盐缓冲液。取非糖尿病和糖尿病大鼠各40只，采用随机数字表法，分别将其分为两个亚组（n=20）：正常假手术组（NS组）、正常心肌缺血再灌注组（NIR组）、糖尿病假手术组（DS组）、糖尿病心肌缺血再灌注组（DIR组）。
1.2 心肌I/R模型 大鼠术前禁食12h,采用腹腔注射1%戊巴比妥钠60mg/kg麻醉固定大鼠。大鼠气管插管后接动物呼吸机行机械通气，皮下电极监测Ⅱ导联心电图。于左锁骨中线第四肋间打开胸腔暴露心脏，在左心耳下缘与肺动脉圆锥间左冠状动脉前降支（LAD）起始部下3mm处以6-0尼龙线结扎，缺血30min,松开结扎线再灌注120min,假手术组只穿线不接扎。判断缺血成功的标准：心尖部及左心室前壁变白，心电图示QRS波增宽，ST段抬高，T波高尖，心室壁运动减弱；再灌注成功的标准：心尖部位及左心室前壁恢复红色，心电图示ST段回落。
1.3 心肌梗死面积测定 每组分别在再灌注结束后随机取6只大鼠，再次结扎LAD,股静脉穿刺注射3%伊文斯蓝1ml,至大部分心脏蓝染后取出心脏，置于-20℃保存2h,于心脏垂直于长轴方向将心脏切成2mm厚的薄片，用PBS配制的1%TTC溶液（sigma公司，美国）37 ℃避光孵育15min,4%多聚甲醛固定20min,用扫描仪拍片。采用Image-ProPlus 6.0图像分析软件分析，正常心肌呈蓝色，缺血心肌呈砖红色，梗死心肌呈灰白色，分析测定心肌缺血面积和梗死面积。
1.4 CK-MB和LDH检测 再灌注120min后，采集动脉血样，离心后取血清，按照CK-MB、LDH活性检测试剂盒说明测定CK-MB含量和LDH活性。
1.5 HE染色 于再灌注120min结束后，取缺血区心尖部心肌组织，用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋后于切片机上切片，HE染色，显微镜下观察病理结果。
1.6 Western Blot 法 检 测 心 肌 组 织NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β的表达于再灌注120min结束时，每组取8只大鼠，处死后取左室心肌缺血区心肌组织100mg,用冰PBS灌洗干净后，加入1 000μlRIPA裂解液，冰上静置30min,再冰浴电动匀浆，4℃下12 000 g离心15min,取上清，用BCA法测定蛋白浓度。加5×上样缓冲液混匀煮沸10 min.Western Blot进行蛋白定量检测，分别用10%分离胶和5%浓缩胶、15%分离胶和5%浓缩胶进行电泳，于PVDF膜上进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h,分别用NLRP3多克隆抗体（1∶200,Novus公司，美国）、caspase-1多克隆抗体（稀释度1∶200,Santa公司，美国）、ASC多克隆抗体（稀释度1∶200,Santa公司，美国）和IL-1β多克隆抗体（稀释度1∶1 000,Abcam公司，美国）进行4℃过夜孵育。TBST洗涤3次，每次10min,用山羊抗兔多克隆荧光二抗（稀释度1∶10 000,Li-Cor公司，美国）室温孵育1h,TBST洗涤3次，每次10min.用Odyssey双色红外激光扫描显影仪（Li-Cor公司，美国）扫描荧光蛋白条带，用Odyssey系统软件进行结果分析，通过目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。
1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x珔±s）表示，两组比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果。
2.1 心肌梗死面积与假手术组比较，缺血再灌注组心肌梗死面积百分比明显增大（P<0.05）；与正常心肌缺血再灌注组相比，糖尿病心肌缺血再灌注组心肌梗死面积百分比增加（P<0.05），见图1、表1.
2.2 CK-MB和LDH活性 与假手术组比较，缺血再灌注组血清CK-MB和LDH的活性升高（P<0.05）；与正常心肌缺血再灌注组相比，糖尿病心肌缺血再灌注 组血清CK-MB和LDH的 活 性 升 高（P<0.05），见表2.
