胰高血糖素样肽素-1对糖尿病患者心肌细胞的保护功能(2)

　　1. 2. 6   Western blot 测定 Bax、Bcl-2 蛋白表达 收集 H9C2 细胞，预冷的 PBS 洗涤 3 次，RIPA 全细胞裂解液冰上裂解 30 min,离心取上清，BCA 法进行蛋白定量。每孔蛋白上样量 30 μg,在 0. 1 聚丙烯酰胺凝胶（ SDS-PAGE） 中进行电泳 70V,电泳 15-20min,待指示剂到浓缩胶与分离胶交界处后，改为120V 继续电泳，直至溴酚蓝完全到凝胶底部停止电泳。置于电转液中，在 250 mA 恒定电流下将蛋白转移至 PVDF 膜上。50 g·L- 1脱脂奶粉封闭 1 h,Bax、Bcl-2 一抗 （ 1 ∶ 1000 稀释） 4 ℃ 孵育过夜，TBST 洗膜 3 次。二抗室温孵育 1 h,漂洗 3 次，ECL显色。用 ECL 检测液发光显影定影后，用 Image J软件进行灰度分析。
　　
　　1. 2. 7   流式细胞仪检测细胞凋亡 收集 H9C2 细胞，预冷的 PBS 洗 2 次，每次均需 300 g,4℃离心 5min,加入 100 μL 1 × Binding buffer 重悬细胞。再加入 5 μL Annexin V-FITC 和 PI Staining solution,轻轻混匀。避光，室温反应 10 min.后再加入 400 μL1 × Binding buffer 混匀，样品在 1 h 内用流式细胞仪检测。
　　
　　1. 2. 8   统计学分析 数据x ± s 描 述，采 用SPSS17. 0 软件进行统计学分析。计数资料两样本间率的比较采用 χ2检验，组间比较采用单因素方差分析。
　　
　　2 结果。
　　
　　2. 1  细胞形态学观察 倒置相差显微镜观察发现：正常 H9C2 细胞呈梭形，排列规整，大小均一，胞核、胞质境界清楚。AGEs 损伤组细胞大小不规则，胞体变圆、皱缩。胞核增大，胞质有空泡出现。AGEs+ GLP-1 组细胞大小较为均一，形态趋向正常，细胞皱缩变形和胞质空泡化减少。
　　 　　2. 2  GLP-1 处理提高 H9C2 细胞生成率 用 CCK-8 法测定细胞生成率，如 Tab 2 示： 根据不同浓度预实验结果并参考文献[11 -12],以 100 mg·L- 1AGEs处理 24h 建立 H9C2 损伤模型，正常对照组，100 mg·L- 1AGEs,AGEs + GLP-1 （ 10 nmol·L- 1） ,AGEs+ NAC（ 5mmol·L- 1） 处理 24 h.结果显示 100 mg·L- 1处理细胞生成率明显降低，而 AGEs + GLP-1组的细胞生成率升高。
　　 　　2. 3  GLP-1 处理抑制 AGEs 诱导的 ROS Fig 2显示，正常心肌细胞内存在少量的 ROS,100 mg·L- 1AGEs 处理 H9C2 心肌细胞 24 h 使胞内 ROS 水平明显增多，与对照组比较，差异具有统计学意义（P < 0. 01 ） .10 nmol · L- 1GLP-1 与 100 mg · L- 1AGEs 共培养 24 h 能明显地抑制 AGEs 诱导的ROS,使胞内 ROS 明显减少（ P < 0. 05） .
　　
　　2. 4  GLP-1 抑制 AGEs 诱导的心肌细胞凋亡 Fig3 显示，与正常组比较，100 mg · L- 1AGEs 处理H9C2 心肌细胞 24h 能使凋亡 H9C2 细胞数量明显增多； 与 100 mg·L- 1AGEs 组损伤相比，100 mg·L- 1AGEs + 10 nmol · L- 1GLP-1、100 mg · L- 1+ 5mmol·L- 1NAC mg · L- 1组对细胞凋亡有抑制作用，差异具有统计学意义（ P <0. 05） .
　　
　　2. 5 GLP-1 抑制促凋亡 Bax mRNA 的表达，增加抑凋亡 Bcl-2 mRNA 的表达 Fig 4 显示，与正常组相比较，100 mg·L- 1AGEs 处理 24 h,促凋亡蛋 Bax含量增加； 抑凋亡蛋白 Bcl-2 含量则减少； GLP-1 处理可以抑制上述改变。与 AGEs 损伤组比较，GLP-1+ AGEs 处理组使 Bax mRNA 减少，Bcl-2 mRNA 增加。