有关猪血胰酶酶解产物的毒理学安全性评价

    猪血酶解产物是将猪血用胰酶水解以后得到的产物。猪血经酶解以后蛋白质被水解成氨基酸和小肽类物质，营养价值得到了提高，将其用于食品开发，不但能解决我国猪血资源大量浪费的情况，还可以提高食品的营养价值，比如强化食品的铁含量，提高蛋白质含量和利用率等[1~4].

　　本次实验所用猪血酶解产物是以新鲜猪血为蛋白源，采用胰酶彻底水解得到的包含氨基酸、小肽类物质、矿物质等的猪血酶解粉粒。根据四川省农业科学院分析测试中心对其成分测定结果来看，其铁含量约为 0.24%,氨基酸总量为 70%~80%.鉴于其营养物质丰富，可将其开发应用于食品中，但有关猪血胰酶酶解产物的毒理学安全性评价尚未报道，为此我们进行本试验，为其安全性评价提供实验依据，从而为合理开发、利用猪血酶解产物资源提供科学依据。本试验参照 《食品安全性毒理学评价程序和方法》（2003 版）[5]中的相关规定，对其进行了第一阶段和第二阶段的试验。

    1 材料和方法
 

　　1.1 材料

    1.1.1 样品 猪血酶解产物干燥物，由四川农业大学食品系提供。

　　1.1.2 试验动物 SD 大鼠、KM 小鼠，由四川大学医学实验动物中心提供。医学实验动物合格证号：SCXK （川） 2009-09.

　　1.1.3 试剂和仪器 上海精密科学仪器有限公司JYIO001 型电子天平；梅特勒一托利多仪器 （上海）公司 AB204-N 型电子分析天平；Abacus 全自动血液分析仪；日立 7600 全自动生化分析；德国 LEICA公司 AO 切片机；日本 Olympus 光学显微镜等。

　　1.2 方法

   1.2.1 急性毒性试验 采用最大耐受剂量法 （MTD法）。大鼠、小鼠各 20 只，雌雄各半，剂量设置为20 g/kg BW,24 h 内两次灌胃，染毒后观察受试动物的体征及死亡情况。

　　1.2.2 遗传毒性实验。

　　1.2.2.1 小鼠骨髓微核试验 小鼠 60 只，随机分为5 组，雌雄各半，设样品 10 g/kg BW、5 g/kg BW、2.5 g/kg BW 3 个剂量组。另设阴性对照组 （蒸馏水）和阳性对照组 （40 mg/kg BW 环磷酰胺）。按要求染毒后观察小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的出现率。

　　1.2.2.2 小鼠睾丸染色体畸变试验 雄性小鼠 30只，随机分为 5 组，设样品 10 g/kg BW、5 g/kg BW、2.5 g/kg BW 3 个剂量组。另设阴性对照组 （蒸馏水）和阳性对照组 （2 mg/kg BW 丝裂霉素 C）。按要求染毒后观察小鼠睾丸染色体畸变类型和畸变率。

　　1.2.3 30 d 喂养试验 SD 大鼠 80 只，随机分为 4组，雌雄各半。由于急性毒性试验未求出 LD50值，本次大鼠 30 d 喂养试验的最高剂量由人铁的推荐摄入量 （按孕晚期妇女的推荐量 35 mg/d） 的 100 倍反推而得，求出最高剂量为 7 g/kg BW,中、低剂量依次为 3.5 g/kg BW、1.75 g/kg BW.采用拌饲法给受试物，在饲料加工时将受试物拌在饲料粉中，各剂量组分别按大鼠进食量为其体重的 10%比例给受试物[7,8],正常对照组喂基础饲料，各剂量组连续 30 d按相应体重喂饲含受试物的饲料。每两天称一次大鼠剩料和撒料，每周称一次大鼠体重，计算大鼠每周和总的体重增长、进食量和食物利用率。试验最末一天处死大鼠，股动脉采血进行血液学测定和血液生化指标测定，并将大鼠大体解剖，取出肝、脾、肾、睾丸、卵巢进行称重，计算脏器系数，然后将这些脏器和胃、十二指肠一起切片，进行组织病理学检查。

　　1.2.4 统计学分析 应用 SPSS 10.0 统计软件，计量资料以均数±标准差 （x±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析；计数资料以均数 （x） 表示，采用卡方检验。

　　2 结 果

　　2.1 急性毒性试验 猪血酶解产物 20 g/kg BW 剂量经口染毒后，两周内未见动物死亡，亦无明显的中毒症状或不良反应。即本检品对雌、雄性昆明种小鼠和 SD 大鼠的急性经口 MTD 均大于 20 g/kg BW,属实际无毒类。

　　2.2 遗传毒性试验

　　2.2.1 小鼠骨髓微核试验 试验组动物在各试验剂量下，PCE 微核出现率与阴性对照组比较，P>0.05,差异均无统计学意义，而阳性对照组微核率与阴性对照组比较，P<0.01,差异有统计学意义。

　　提示猪血酶解产物在小鼠骨髓微核试验中为阴性结果。见表 1.

　　2.2.2 小鼠睾丸染色体畸变试验 试验各组的总畸变细胞率、常染色体单价体率和性染色体单价体率与阴性对照组比较，P>0.05,差异均无统计学意义。而阳性对照组的总畸变细胞率、常染色体单价体率和性染色体单价体率与阴性对照组比较，P<0.01,差异均有统计学意义，提示猪血酶解产物在小鼠睾丸染色体畸变试验中为阴性结果。见表 2.

　　2.3 30 d 喂养试验

　　2.3.1 一般表现 试验期间，各组大鼠活动、进食、行为未见异常，均未出现中毒症状和死亡情况。

　　2.3.2 对大鼠体重、食物利用率的影响 试验期间，各剂量组大鼠每周平均体重、每周食物利用率和总的食物利用率与对照组比较，P>0.05,差异无统计学意义。表明猪血酶解产物对大鼠体重、食物利用率无明显影响，详见表 3、表 4.

　　2.3.3 血常规和血液生化指标 由表 5、表 6 可知，雌性高剂量和雄性低剂量组血红蛋白、雌性中高剂量组血小板数低于对照组，差异有统计学意义 （P<0.05）；雄性中剂量组天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶、雌性低高剂量组和雄性低高剂量组尿素氮高于对照组，雌性高剂量组和雄性中剂量组血糖值低于对照组，差异有统计学意义 （P<0.05）。不过这些指标均无剂量 - 反应关系，且值均在正常范围内[9~11].

　　另外，大部分剂量组胆固醇和甘油三酯均低于对照组，且差异有统计学意义，提示猪血酶解产物可能具有降胆固醇、甘油三酯的功效，但仍需做进一步的功能性评价试验加以确认。

　　2.3.4 脏器系数及病理组织学检查 对大鼠进行大体解剖，各脏器均无明显病变，其脏器系数测定结果见表 7.由表 7 可知，试验组各脏器系数与对照组比较，差异无统计学意义，且所有脏器系数均在本实验室测定的历史正常范围内[12].对脏器进行组织病理学检查，未发现由中毒引起的病变。故认为本次试验所测定的猪血酶解产物在本次试验所设定的剂量范围内对大鼠的实质器官无明显不良影响。

　　3 讨 论

　　对猪血酶解产物进行安全性评价，急性毒性试验经口 MTD>20 g/kg 体重，属无毒级。骨髓微核试验和睾丸染色体畸变试验结果均为阴性，说明本次试验测定的猪血酶解产物在本次试验所设定的剂量范围内无遗传毒性。大鼠 30 d 喂养试验，雌雄各剂量组的每周体重、食物利用率与对照组比较，差异均无统计学意义，表明猪血酶解产物对机体生长发育无不良影响。血常规中血红蛋白和血小板等指标有个别剂量组与对照组比较，差异虽有统计学意义，不过无剂量 - 反应关系，且值均在正常范围内，故无生物学意义。血生化中天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶这两种酶虽然有部分剂量组高于对照组，但是 Vincent P. Meador 等认为当这两种酶低于对照组的 2~3 倍，且组织病理学检查结果为阴性时，不能判定实验动物肝脏受到了损害。本实验中，这两种酶只有在雄性中剂量组有所升高，升高幅度小于对照组的 2 倍，而且所有指标均在本实验室所测定的历史正常范围内[9],结合组织病理学镜检的阴性结果，可认为这两种指标的偏高无生物学意义，即猪血酶解产物对大鼠的肝脏无明显不良影响。此外，尿素氮在部分剂量组中有所升高，但这种升高无剂量 - 反应关系，且值也在本实验室所测定的历史正常范围之内，结合肾脏组织病理学检查结果可知，受试物对大鼠肾脏无明显不良影响。综上可以得出，猪血酶解产物在所设剂量范围内对大鼠脏器无明显不良影响。在本次试验中，各个剂量组的甘油三酯、胆固醇均明显低于对照组，且显示出一定的剂量 -反应关系，提示猪血酶解产物可能具有降低胆固醇、甘油三酯的功效。方俊等[13]的研究显示猪血多肽有辅助降血脂的功效，因此可能是受试物中猪血多肽的作用，使得剂量组受试动物血脂降低。

　　猪血酶解产物含丰富的氨基酸和微量元素，具有很大的开发应用前景，本次试验提示猪血酶解产物属无毒级、无遗传毒性，对受试动物的生长发育、脏器均无明显不良影响，故可认为猪血酶解产物在本次试验所设定的剂量范围内是安全的，可以用于食品开发，但开发的食品属于新资源食品，仍需进行毒理学安全性评价以后才能上市。

　　参考文献：

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　　[4] 陈一资，胡惠民，黄乾明，王得众，纪斗朝，郭德彬。 猪血酶解工艺研究[J]. 资源开发与市场，1996,12 （4）：147-149.
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　　[13] 方俊，田云，卢向阳，等。 猪血多肽辅助降血脂功能研究[J].