神经生长因子在眼科应用基础研究的新进展

　　神 经生长因 子(nerve growth factor,NGF)是 20世纪 50 年代初由 Levi-Montalcini 在小鼠肉瘤细胞内发现的第一个神经营养因子[1],是一类由神经元、神经支配的靶组织或胶质细胞产生的能促进中枢和外周神经分化、生长和存活的活性蛋白质.由于基于 Levi-Montalcini 和 Cohn 的研究,人们对许多 NGF 相关疾病产生了新的认识,包括神经发育异常、老年性痴呆症、伤口愈合、肿瘤、视神经损伤和再生等.近年来,国外许多体内及体外的实验研究表明 NGF 在治疗视觉系统的一些疾病如视网膜色素变性、视神经炎、眼挫伤、青光眼、角膜炎、干眼病等所引起的视神经萎缩以及缺血性视神经病变、视网膜脱离术后视功能差等有较好的疗效[2-4].

　　1  NGF 受体在眼组织中的表达及其介导的信号通路

　　NGF 可以与细胞膜表面的高亲和力酪氨酸激酶A(tyrosine kinase A,TrkA)受体及低亲和力受体(p75neurotrophin receptor,p75NTR)结合,通过受体介导的自身磷酸化及内吞机制,进一步激活下游酪氨酸蛋白激酶、磷脂酰肌醇、细胞内第二信使体系等一系列级联反应,对靶细胞(如神经元)的某些功能进行调控[5].早期即有研究表明在动物虹膜、晶状体、视网膜、视神经中存在眼内源性 NGF 及其受体.在视觉系统,NGF 受体存在于个体发育大鼠的视网膜、视神经、视束以及视系统的上丘、外侧膝状体、顶盖前区和视交叉上核的视网膜神经节细胞轴突末梢及成年大鼠视交叉上核中与神经纤维末梢的相关区域.视网膜中神经节细胞、Muller 细胞具有 NGF 受体[6].p75NTR在视觉靶区的表达是多源性的,可受许多因素的调节和影响[7-8].Ghinelli 等[7]证明小鼠晶状体上皮细胞表达并合成 NGF 及其受体,通过 ELISA 技术测定小鼠晶状体上皮细胞 NGF 含量为(54.0±24.5)pg·g-1.Hayash 等[9]亦证实在猕猴视皮层中含有 NGF,含量为 5~10 pg·g-1.Caminos 等[10]通过原位杂交及免疫组织化学的方法测定鱼类视网膜的 NGF 发现:除了 Muller 胶质细胞突起,鱼类视网膜从神经纤维层至外界膜都有 NGF 的广泛分布.成熟NGF 和 NGF 原蛋白(pnNGF)的免疫反应性出现在大鼠视网膜神经节细胞、Muller 细胞、视网膜色素上皮细胞以及与内界膜相邻的区域,且糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠 NGF 和 pnNGF 免疫反应性的强度与分布相同,表明 NGF 在视网膜内可由神经元性和非神经元性细胞内源性合成.

　　如前所述,NGF 在细胞膜表面的受体有两类:TrkA及 p75NTR,这两类受体介导的生物功能或病理反应不完全一致,特定情况下甚至产生相反的作用.TrkA 是NGF 的高亲和力受体,也是 NGF 发挥生物学效应的主要受体,NGF 与其结合后,TrkA 受体的胞内部分发生自磷酸化从而被激活,活化的 TrkA 激活下游蛋白激酶,进一步磷酸化并活化蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulatedkinase,ERK)等激酶.PKB 及 ERK 是 NGF/TrkA 下游重要的促进存活的激酶,PKB 及 ERK 在神经细胞及非神经细胞内均具有广泛的生物学功能[12].同时,TrkA还可以活化细胞膜上的 G 蛋白,G 蛋白再活化磷脂酶C-γ(phospholipase C-γ,PLC-γ),PLC-γ 进而激活第二信使二酰基甘油及三磷酸肌醇,再动员钙离子,最终触发核内基因表达的开启或关闭[13-14].p75NTR为NGF 的低亲和力受体,但 p75NTR并非 NGF 的特异性受体,即其他生长因子如脑源性神经生长因子、神经营养因子 -3 及神经营养因子 -4 都可以和 p75NTR结合,介导 p75NTR的生物学作用,p75NTR被激动后,可以通过活化下游核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB),NF-κB可进入细胞核内,促进促存活相关蛋白的表达,也可以通过激活下游的 c-Jun 氨基末端激酶(c-jun N-terminalkinase,JNK)信号通路,JNK 通路为经典的促凋亡通路,而TrkA活化后,则可以抑制p75NTR对JNK的活化作用,但对 NF-κB 没有影响,p75NTR可以增加 NGF 与 TrkA的结合力[15].综上所述,NGF 在细胞的信号通路较为复杂,其最终发挥怎样的生物学作用,很大程度上取决于细胞上受体的表达情况及细胞所处的微环境状态.

　　2  NGF 及其受体对视神经损伤的保护

　　Maffei 等[16]研究发现在切断视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)轴突后,通过提供 NGF,RGC 可免于死亡,说明 NGF 对 RGC 具有一定的保护作用.有研究数据显示,NGF 作用于神经元 TrkA 受体时,对神经元有保护作用,而与神经胶质细胞 p75NTR结合,拮抗此作用[17].Lebrun-Julien F 等[18]运用 p75NTR阻断剂,有利于受损的视网膜神经节细胞的修复,这一效应通过增强 TrkA 的介导效应而实现.Zhong Y 等[19]报告使用 NGF(im,30 μg·次-1)治疗 5 例患有视神经严重挫伤的患者,应用 NGF 治疗三周后,患者的视觉功能得到恢复.Rudzinski 等[20]在大鼠眼压升高后测定 NGF 及其受体水平都有所上升,但是两者上升水平并不一致,从而推测这种变化可能延缓了 RGC 细胞的凋亡.钱道卫等[21]通过对兔视网膜损伤后髓鞘碱性蛋白的研究,观察蛇毒神经生长因子(vNGF)对慢性高眼压下兔 RGC 的保护作用,结果表明,vNGF 能降低高眼压后视网膜髓鞘碱性蛋白的含量,提高 RGC 的存活数量,对 RGC 损伤后的修复有明显的促进作用.

　　国内相关研究显示,使用 NGF(肌肉注射 / 球后注射 2次 / 周)治疗 40 例外伤性视神经病变的患者,治疗后视觉诱发电位 P100 波幅均值比治疗前明显缩短,表明NGF 可能有助于视神经损伤后修复[22];另一报告使用NGF 治疗 39 例(47 眼)视神经病变患者,10 d 为一疗程,患者视力有明显恢复,有效率明显高于对照组(86% vs15%)[23].目前 NGF 在眼科应用较多,于强等 2004 年采用随机、双盲、多中心临床研究,用 NGF 治疗 407 例视神经挫伤患者,肌肉注射 NGF 30 μg(生物学活性≥15 000 AU),每日 1 次,治疗 6 周,以视力视野和视觉诱发电位为疗效观察指标,3 周及 6 周时的有效率分别为58.55% 和 77.96%,进一步证实了 NGF 治疗视神经损伤的疗效[24].

　　3  NGF 对角膜损伤的修复

　　角膜组织作为最重要的屈光间质,由于其结构和功能的特殊性.损伤后常严重影响视功能,NGF 是一种小分子多肽类神经营养因子,能够促进角膜上皮细胞增生和移行,并可调节角膜缘干细胞的分化和增生,还可通过刺激多种神经肽及其它生长因子的释放来促进神经再生、加快角膜创伤后愈合.

　　近年来许多研究显示 NGF 在角膜损伤修复过程中起重要作用.Kruse 等[25]发现 NGF 能够促进体外培养的兔角膜上皮细胞以及角膜缘干细胞的有丝分裂,加速其生长与分化.圆锥角膜作为最常见的角膜营养不良性疾病,目前临床上唯一有效治疗方法为角膜移植.但 Lambiase 等[26]发现圆锥角膜患者角膜中TrkA 表达完全缺失,NGF 及 p75NTR的表达下降.故推测 NGF 及其受体水平的变化可能与圆锥角膜的发生有关,为圆锥角膜的治疗提供了新的思路.临床报道中,NGF 对患者角膜的修复,也具有显着疗效.Lambiase等[27]1998 年报告局部使用 NGF 治疗各种原因(神经营养性、化学性烧伤、麻醉药滥用、听神经瘤、第Ⅵ神经瘫痪、病毒感染、角膜手术、糖尿病、多发性硬化等)引起的角膜炎和角膜溃疡共 14 例,结果 NGF 具有促进角膜愈合、恢复角膜的完整性、恢复角膜知觉、促进角膜瘢痕透明化的作用,说明 NGF 治疗角膜炎和角膜溃疡的有效性和安全性.Bonini 等[28]2000 年报告局部通过对 43 位神经营养性角膜患者保守治疗无效后应用 NGF 治疗发现,所有患者的角膜溃疡均愈合,角膜知觉和视觉明显改善.Wu Y 等[29]2009 年报告准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)术后局部给予 NGF 能够明显改善角膜知觉,对角膜的早期恢复起重要作用.进而 NGF 可能成为治疗 LASIK 术后干眼症的新手段.Lambiase A 等[30]利用 NGF 滴眼液治疗由皮下注射辣椒素引起的角膜周围感觉神经损伤,结果显示,NGF 对角膜愈合起到至关重要的作用.Coassin 等[31]发现应用 NGF 能治疗泪腺切除术后狗的浅层点状角膜病变,减轻角膜雾状混浊,提高角膜敏感度及视觉表面泪液的量及功能.角膜上皮细胞层缺损需由临近角膜上皮细胞的增生和移行来修复.Blance-Mezquita T 等通过实验观察发现,NGF 能通过增加基因金属蛋白酶 -9 和TrkA 的表达,从而促进角膜上皮细胞增殖和移行,与对照组相比,NGF 治疗组能加快角膜上皮细胞愈合速率[32].余洁等[33]观察兔眼准分子激光 LASIK 及准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术(Epi- LASIK)术后局部点用 NGF 后角膜组织中 TrkA 的表达情况,探索术后干眼症的防治方法,结果观察到 TrKA 在角膜上皮细胞层以及角膜基质中的表达增多,接受 LASIK 或 Epi-LASIK 手术后,滴用 NGF 滴眼液的眼均较对照眼强,说明滴用NGF,可能有助于防止近视激光术后干眼症.

　　4  NGF 对视网膜损伤的保护

　　NGF 对视网膜保护作用可概括为 2 类:① NGF 具有使神经细胞存活率增高的活性,可保持 RGC 的存活;②可促进 RGC 轴突的再生和视神经纤维的延长,诱导突起的定向生长,决定神经纤维生长的方向.

　　近年来眼科实验多为 NGF 在视神经视网膜疾病中的治疗研究,证明 NGF 对视网膜三级神经元有较强的保护作用,NGF 能够保护 RGC、支持 RGC 及神经纤维存活,在视网膜受损时促进其修复.陈萍[34]报道 NGF在治疗视神经视网膜挫伤时,可有效保护效应神经元,不同程度地减轻损伤造成的后果,并能促进神经纤维的再生及功能恢复.联合血管扩张剂使用既增加了受挫视网膜、视神经的血供和营养,对衰老及被破坏的神经细胞有不同程度的修复和保护作用,又能促进细胞再生和功能恢复,对视力、图形视觉诱发电位和视野有明显改善.周欢粉等[35]成功建立实验性视神经炎小鼠模型,通过玻璃体腔注射外源性鼠神经生长因子,观察NGF 对模型小鼠视网膜神经组织的保护功效,结果显示,NGF 可以促进脱髓鞘性视神经炎小鼠视网膜神经节细胞的存活,对其视网膜神经组织可能具有一定的保护作用.杨超等[36]应用免疫组织化学法检测各组小鼠视网膜组织凋亡相关基因 c-fos、c-jun 蛋白的表达,对照组视网膜组织 c-fos、c-jun 几乎不表达,NGF 组及光照组 c-fos、c-jun 表达均明显升高,说明 NGF 对视网膜有保护作用,其机制可能为抑制 c-fos、c-jun 的表达,减少视网膜细胞凋亡.国内报告采用 NGF 治疗视神经视网膜挫伤 48 例(59 眼),以视力视野和视觉诱发电位为疗效观察指标,治愈率 83.1%,显效率为 16.95%[37].卫玉荣等[38]在临床应用 NGF 治疗视神经视网膜挫伤的研究中发现,伤后早期应用 NGF 联合血管扩张剂治疗,对减轻伤后视神经视网膜内的实质性水肿及炎症反应、营养修复受损的视神经视网膜具有显着疗效.采用NGF 联合复方樟柳碱治疗视神经视网膜挫伤 56 例(62眼),有效率达 87.1%[39].近年来有新的研究发现 NGF可通过与血管内皮细胞表面 NGF 高亲和受体 TrkA 结合促进脐静脉、大动脉血管内皮细胞的增殖,加强血管增生的活性[40].继而王丁丁等通过实验观察到NGF 能增加人视网膜血管内皮细胞的含量,导致新生血管的形成.运用特异性 TrkA 阻断剂 K252a,可治疗由缺血低氧促发大量视网膜异常新生血管形成造成的视网膜损害.

　　NGF 对视网膜缺血 - 再灌注的治疗也可发挥重要作用.Siliprandi 等[42]和 Tomita 等[43]分别采用眼内注射和玻璃体注射外源性 NGF 的方法促进缺血 RGC 功能恢复.王瑛等[44]研究发现玻璃体腔内注射 NGF 可减轻视网膜缺血 - 再灌注损伤对视网膜超微组织结构的损害,并有促进细胞功能恢复的作用.杨莹等[45]进一步研究发现玻璃体腔内注射 NGF 可明显减少视网膜缺血 - 再灌注损伤视网膜组织中凋亡调控基因 c-fos/c-jun 蛋白的表达,抑制神经细胞的凋亡,表明玻璃体腔内注射 NGF 对视网膜缺血 - 再灌注损伤有治疗作用,NGF 有效作用时间为 24 h.

　　5  NGF 对青光眼的治疗

　　青光眼是一种由病理性眼压升高导致特征视神经损伤和视野缺损的致盲性疾病.传统的小梁切除术可以降低眼内压,延迟视神经的损伤.随着人们对青光眼发病机制的深入研究,对青光眼的治疗不仅仅局限于降低眼压,视神经保护方法配合降眼压治疗作为一种更有效的治疗方法已经应用到临床中.孟佳等[46]对 47 例青光眼患者行小梁切除术后采用鼠神经生长因子治疗,青光眼术后给予神经生长因子治疗有助于患者视功能的恢复.孙路建[47]对 100 例急性闭角型青光眼视神经损伤,对照组 48 例给予三磷酸腺苷和复方丹参注射液,治疗组 52 例给予鼠神经生长因子和长春西汀.结果对照组视力有效率 61%,视野有效率 59%;治疗组视力有效率 91%,视野有效率 90%,说明鼠神经生长因子联合长春西汀治疗急性闭角型青光眼视神经损伤有较好疗效.Lambiase A 等[48]应用 NGF 滴眼液治疗 33 位严重青光眼患者,三个月的时间,每天使用 4 倍剂量的 NGF 滴眼液,结果显示其中 22 名患者的周围视觉、视觉敏感度、对比敏感度,以及对视觉系统中的神经传导进行的电生理学测试结果,都得到了提高.

　　Colafrancesco V 等[49]通过实验发现 NGF 能提高由青光眼、糖尿病视网膜病变引起的 RGC 的存活率.进一步的研究显示,NGF 的视神经保护作用主要是通过其高亲和力受体 TrkA 来介导的,特异性针对 TrkA 受体的激动剂具有明显的促进视神经节细胞存活的作用[50].

　　6  NGF 对弱视的治疗

　　弱视是较为常见的儿童病变,是由于先天性或视觉系统发育关键期内受到某些因素(如斜视、屈光不正、先天性白内障等)的干扰,所造成的单眼或双眼视力减退.近十余年,NGF 与弱视的关系研究取得了很大进展,已知 NGF 可以促进交感及感觉神经元的分化与成熟,在视觉敏感期应用 NGF 抗体可延迟视觉系统突触的发育[50].Giorgio 给予单眼剥夺幼猫静脉注射 NGF,观察视皮质和外侧膝状体的变化发现,应用 NGF 可防止视皮质双眼细胞的减少,且外侧膝状体相应层的神经细胞未见明显萎缩[51].单眼剥夺性弱视猫,重新打开剥夺眼,再应用 NGF 治疗,与未应用 NGF 的对照组相比,原剥夺眼的视功能明显改善.有人发现 NGF 可阻止斜视所造成的视皮层双眼细胞的减少,局部应用NGF 可逆转弱视猫视皮层眼优势柱的偏移,改善弱视眼的视功能[52].Domemd 等[53]利用电生理的方法也发现 NGF 能提高弱视鼠的视觉敏感度及对比敏感度.国内外的研究已证实 NGF 参与视觉发育和视觉经验(学习记忆)变化过程,NGF 参与了形觉剥夺性近视巩膜的重新塑形,NGF 可有效预防大鼠的弱视和斜视,并增加视觉系统的可塑性[54].

　　7  结语与展望

　　NGF 在眼科应用基础研究涉及的范围较为广泛,包括眼后节的视神经和视网膜病变,也包括眼前节角膜疾病,临床研究集中在视神经病变、视网膜病变、角膜病变等方面[55].目前有大量实验证据证实 NGF 在眼科疾病的治疗中具有明显的疗效,其作用大多通过结合于其高亲和力受体发挥,但同时也要注意到 NGF 单独与位于胶质细胞上的 p75NTR结合后可介导细胞的凋亡,因此给予 NGF 治疗的同时,阻断 p75NTR的作用,或只激动 TrkA 将可能起到更好的作用.另外,研究显示 NGF局部给药后,会出现明显的局部疼痛[56],这一作用是否会阻碍 NGF 在临床上用于眼科疾病的治疗,还有待大规模的临床调查.综上所述,对 NGF 的作用机制及临床效应的理解及认识还有待提高,但其促进神经元损伤后修复再生的效用对于许多眼病的治疗不失为一个很好的研究方向.

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