鬼针草滴眼液对去势雄兔干眼症的治疗效果分析

　　干眼症是由于泪液的量或质的异常引起的泪膜不稳定和眼表面损害，严重影响患者视力和生活，且患病率逐年上升。眼部是性激素作用的重要靶器官之一，雄激素、雌激素、孕激素和催乳素受体广泛存在于人、兔和鼠的泪腺、睑板腺及角膜等眼表组织[1],而性激素水平下降，泪膜不稳定、局部炎症反应加重，导致了干眼症的形成。对于雄激素水平下降导致的干眼症患者，目前多以局部对症治疗，而雄激素替代治疗副作用多，患者不易接受。因此，临床寻找一种新的激素替代药物成为了眼科急需解决的问题。鬼针草是一种天然植物雄激素，既可补充人体雄激素不足，也可与细胞表面雄激素受体结合发挥微弱雄激素效应，在雄激素水平下降时可能具有独到效果[2].我们前期已经报道了鬼针草叶水煎液能用于治疗更年期和绝经期女性干眼患者的症状和部分体征[3-4],为了进一步探讨鬼针草滴眼液对此类干眼症效果，首先制作去势雄兔干眼症模型，测定其给药前后基础泪液分泌量和泪液蛋白变化，然后将其用于治疗去势雄兔干眼症的动物试验研究。现报告如下：

　　1资料和方法

　　1.1鬼针草提取液的制备

　　参考文献[5]的方法制定鬼针草有效部位的提取方案。鬼针草全草20kg,70%乙醇提取2次，第1次加入8倍量，第2次加入6倍量，合并乙醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，将浓缩液真空干燥，粉碎。依次用CHCl3和EtOAc萃取，每次加入6倍量，得到鬼针草提取液。

　　1.2鬼针草滴眼剂的制备

　　以蒸馏水溶解鬼针草提取物，水：提取物质量比为1∶0.1,加入眼润滑剂羧甲基纤维素，浓度控制1.5%,加入NaHCO3以及KCl作为缓冲系统，浓度控制在0.1%以下。此时检测理化特性：pH值、渗透压、比重、表面张力、粘稠度和屈光指数，之后调整鬼针草提取物、眼润滑剂、缓冲系统的含量，使之尽量达到：①pH:7.3~7.8;②渗透压：311~350mOsm;③比重：约等于1;④表面张力：40~50dyn/cm2;⑤粘稠度：略高于水；⑥屈光指数：1.336的标准。最后加入保存剂苯扎溴铵，其浓度控制在0.005%.

　　1.3分组及手术

　　新西兰大白兔48只（2月龄，均为雄性，体重2.0~2.5kg）。裂隙灯显微镜、眼底镜检查眼前节及眼底无异常，SchirmerI试验（SchirmerItest,SIT）≥10mm/5min.由南昌大学动物实验室提供。参照马轶群等的方法[6],将36只雄兔行双侧睾丸切除术（orchiectomized,ORX）。将这36只随机分为3组（每组12只，均为右眼）：对照PBS组（A）、鬼针草滴眼剂组（B），连续滴眼2月，每日4次。C组12只雄兔手术后不滴眼液，作为阳性对照。另12只雄兔切开阴囊，不切除睾丸，作为阴性对照，术前肌肉滴注青霉素针200000U,术后连续3d肌肉注射青霉素针200000U,预防感染。分别于术前、术后1周、2周、1月及2月对患者行SIT检查、角膜荧光素染色、泪液蛋白测定及角膜共聚焦显微镜扫描。

　　1.4SIT检测及角膜荧光素染色

　　SIT检查泪液基础分泌情况。取5mm×35mm有刻度的试纸，一端反折5mm,轻轻放入被测眼下结膜囊的中外1/3处，5min后取出滤纸，测量湿长。参照张梅等的标准，以≥10mm/5min为正常[7].每组动物均由同一人检查，每组动物每次检查时间、地点、照明亮度、湿度及温度相同。角膜荧光素染色：将1滴1%荧光素钠滴眼，嘱其瞬目，评分系统参考国家眼科研究临床干眼评分[8],分为4级，0级：无染色；1级：很少的播散性污渍染色；2级：中度污渍染色，程度在1~3级间；3级：重度融合性污渍染色。

　　1.5泪液蛋白测定

　　所有的泪液样品在9点到11点收集，毛细吸管吸取患者下泪河约20μl非刺激性泪液，用0.5mlEP管保存，置于-80℃冰箱中。以小牛血清白蛋白为标准，Brandford泪液总蛋白含量。淀粉酶活性[9]:使用ethylidene-4-nitrophenyl-α-d-maltoheptaoside（LeadmanGroupCo,Ltd.,Beijing,China）作为底物。

　　检测处的双色读数在405nm和546nm采用自动生化分析仪分析（LX20;Beckman,Fullerton,CA）；乳铁蛋白测定采用放射免疫分析法[10]:取泪液样品10μl,生理盐水1∶100稀释，制作标准曲线后计算出乳铁蛋白含量。溶菌酶含量采用试管比浊法测定，溶菌酶测试盒、染色菌液制备、溶菌酶标准液配制及标准曲线的绘制均按说明书进行；将泪液及染色菌液混匀，离心后取上清液，根据测定管与样品对照管光密度差值，查标准曲线后得出样品中溶菌酶含量。

　　1.6共聚焦显微镜检查

　　采用Confoscan4裂隙扫描共聚焦显微镜（NidekCo.LTD,日本）检查，操作步骤参考文献[11]:待检兔眼表麻后，将兔头部固定在显微镜前，双眼固视正前方，检查者移动镜头使共焦显微镜与角膜上皮细胞时，将镜头缓慢向前推进，于中央角膜处进行全层扫描，结束后选择有价值的图像与录像存盘，并计算角膜上皮基底细胞及炎症细胞密度。

　　1.7统计学方法

　　采用GraphPadPrism4.00统计软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，计数资料用χ2检验，检验水准均为α=0.05;各组治疗前后及两组间同一时间点的均数比较采用单向方差分析student-t检验及Dunnett检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1治疗前后及两组间各项干眼检测指标评定结果比较

　　治疗前A、B两组SIT相比，差异无统计学意义（tSIT=0.853,P>0.05）；治疗2月后，B组SIT较治疗前均有不同程度改善，差异有统计学意义（tB1wk=5.753,tB2wk=6.096,tB1mo=7.835,tB2mo=10.732,P<0.05），而A组SIT较治疗前明显恶化，差异有统计学意义（tA1wk=3.268,tA2wk=4.637,tA1mo=5.532,tA2mo=6.574,P<0.05）；A、B两组各时间点SIT相比，差异均有统计学意义（t1wk=3.762,t2wk11mo=7.625,t2mo=12.064,P<0.05,详见表1.

　　治疗前A、B两组荧光素染色评分相比，差异无统计学意义（tFL=0.732,P>0.05）；治疗2月后，B组荧光素染色评分较治疗前均有不同程度改善，差异有统计学意义（tB1wk=3.126,tB2wk=2.514,tB1mo=4.335,tB2mo=5.587,P<0.05），而A组荧光素染色评分较治疗前明显恶化，差异有统计学意义（tA1wk=3.221,tA2wk=4.674,tA1mo=6.631,tA2mo=8.159,P<0.05）；A、B两组治疗后2周，1月，2月荧光素染色评分相比，差异均有统计学意义（t1wk=1.329,t2wk=4.469,t1mo=6.663,t2mo=9.597,P<0.05）。见表2.

　　2.2两组用药前后各时间点泪液蛋白比较

　　治疗前A、B两组泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比较，差异无统计学意义（ttotalproteins=10.476,tlysozyme=7.965,tlactoferrin=7.842,tamylaseactivity=5.224,P>0.05）；治疗2月后，A、B组泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性与治疗前相比差异有统计学意义（tA1wk=0.167,tA2wk=0.638,tA1mo=0.535,tA2mo=0.783;tB2wk=0.539,tB1mo=0.694,tB2mo=1.015,P<0.05）；A、B两组各时间点泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比，差异均有统计学意义（t1wk=0.153,t2wk=0.226,t1mo=0.217,t2mo=0.159,P<0.05）。见表3.