人脐带间充质干细胞神经分化潜能与方法

　　糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy,DR）是糖尿病最为常见的微血管并发症之一，在微血管系统病变前已出现神经组织的慢性退行性变，包括神经元凋亡和反应性神经胶质细胞增生等[1].探讨DR神经损伤机制以阻止其发生发展是目前眼科研究的前沿与焦点[2].间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC）是来源于胚胎中胚层的一类成体干细胞，具有向多胚层细胞分化，向组织损伤部位定向迁移并促进损伤修复、免疫抑制、抗炎以及神经营养等功能[3].MSC不仅来源丰富，还具有较强增殖、分化及免疫调节能力，其分泌的各种细胞因子能够抑制细胞的凋亡，促进神经修复及加强神经稳定[4].为此，本文采用取材方便、具有多向分化潜能的人脐带组织中分离的MSC（UC-MSC）,对其进行传代培养和性质鉴定，并探讨其神经分化潜能及神经分化的有效方法，以期为将来应用UC-MSC临床治疗DR神经损伤提供理论基础。

　　资料与方法

　　一、实验方法

　　1.UC-MSC的分离培养：取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，以PBS充分冲洗，剔除脐动、静脉，剩余的间质组织切割成直径约1~2mm大小的组织块。细胞培养液DMEM培养基和N2/B27培养基（美国GIBCO公司）用重蒸水配制，过滤消毒，加入100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素抗菌，在DMEM中加入10%FBS、EGF（5ng/m1）、bFGF（5ng/m1）、25mM谷氨酰胺等。将处理的脐带组织块置于配制的含10%的FBS的细胞培养液中，在6孔板中于含有5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养，新生细胞呈贴壁生长，待细胞生长至融合时传代。用0.25%的胰蛋白酶（含1mmol/L的EDTA）消化3~5min,离心弃上清，细胞稀释4-5倍继续培养，以相差显微镜观察并拍照。

　　二、UC-MSC的鉴定

　　1.采用流式细胞仪对MSC表面特异性抗原进行检测，鉴定细胞的生物学特性。细胞达80%汇合后，以0.2%的胰酶/EDTA消化并按1:2~1:3的比例传代。收集第3代细胞，以2×104个/ml接种于24孔板，隔日取3孔贴壁细胞，将待检细胞样品分为每管0.1ml,加入PE-CD73、FITC-CD105、PE-CD34、PE-CD35、PE-CD19、FITC-CD90、PE-CD11b、FITC-IgG1和PE-IgG1流式抗体一抗（美国Sigma公司）,4℃孵育30min,加入荧光标记的二抗，4℃孵育30min,最后用100ml/l甲醛溶液固定细胞，用流式细胞仪（美国BD公司）测定各类抗原的阳性率。

　　2.鉴定MSC体外多向诱导分化潜能。以生长良好的第3代细胞为实验细胞。细胞经消化后调节密度为2×104个/ml,分别接种入12孔培养板和预置盖玻片的6孔培养板，24h后细胞完全贴壁，更换分化诱导培养基并分别设对照组。向成骨细胞诱导分化：以成骨诱导培养基培养（DMEM/F12培养基，100ml/LFBS,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/L抗坏血酸）,每3~4d全量换液1次，培养至第4周时行碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色。向脂肪细胞诱导分化：以成脂肪诱导培养基培养（DMEM/F12培养基，100ml/lFBS、地塞米松1μmol/l、胰岛素5μ/ml、吲哚美辛0.5μmol/l）,每3~4d全量换液1次，培养至第21天时作油红"O"染色。

　　三、UC-MSC诱导神经分化培养

　　1.向神经干细胞诱导分化培养：取第5代UC-MSC,以2×104个/ml接种于24孔板上，进行诱导分化。在细胞贴壁生长达到60%~70%密度时，更换培养液，加入诱导培养基诱导。诱导培养体系为含2%N2/B27,100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的无血清neurobasal培养基，EGF（5ng/m1）和bFGF（5ng/m1）.置37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养18~20d.每3d添加诱导因子1次，每7d换液1次，观测细胞形态改变。

　　2.向神经元细胞诱导分化培养：取第5代UC-MSC,以2×104个/ml接种于24孔板上，进行诱导分化。在细胞贴壁生长达到60%~70%密度时，更换培养液，加入诱导培养基诱导。诱导培养体系为DF12添加EGF（10ng/m1）和bFGF（10ng/m1）、10μMForskolin、0.5μM全反式维甲酸、0.1mMIBMX、10ng/mlBNDF以及5%胎牛血清。置37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养7d.每3d换液1次，观测细胞形态改变。

　　四、免疫细胞化学检查

　　用Nestin、NeuroD1、MAP2、NF-M单克隆抗体对诱导的神经细胞进行免疫组织化学染色。神经干细胞诱导后，以4%的多聚甲醛固定，正常兔血清封闭，加入一抗NES（1:150）或NeuroD1（1:100）于4℃孵育过夜，PBS洗涤后加入FITC标记的兔抗小鼠或羊抗兔二抗于室温孵育30min,Olympus荧光显微镜观察、计数并拍照。神经元细胞诱导后，以4%的多聚甲醛固定，正常兔血清封闭，加入一抗MAP2（1:150）或NF-M（1:100）于4℃孵育过夜，PBS洗涤后加入FITC标记的兔抗小鼠或羊抗兔二抗于室温孵育30min,Olympus荧光显微镜观察、计数并拍照。

　　五、RT-PCR检测

　　取5×106个/ml诱导分化后的神经细胞，以Tr-izol常规提取总RNA.逆转录反应为40μl体系，含2μg总RNA、25μg/ml的随机引物、0.5mMdNTP、1.5mMMgCl2、10mMDTT、1×buffer和2μlRNA酶抑制剂和2μlM-MLV,PCR仪扩增35个循环。引物由宝生物工程有限公司合成。正反引物及扩增产物的长度如下：β-actin引物F:5'-CATGGGTCAGAAGGATTCCT-3',R:5'-TGATCTGGGTCATCTTCTCG-3'（396bp）退火温度53℃.Nestin引物F:5'-AGCTGGCGCACCTCAAGATG-3';R:5'-AGGGAAGTTGGGCTCAGGAC-3'（495bp）,退火温度53℃;Neurod1引物F:5'-CGCTGGAGCCCTTCTTTGAA-3';R:5'-GCGGACGGTTCGTGTTTGAA-3';MAP2引物F:5'-AATCAGCTCTGGCTCCCAGT-3';R:5'-AGTGGGTGTTGAGGTACCAC-3'（342bp）,退火温度52℃；NF-M引物F:5'-GAGGCGGCCAGTTATCAGGA-3';R:5'-GTTCTCCTCGCCCTCTAGCA-3'（168bp）,退火温度52℃.扩增产物用1.0%（质量分数）琼脂糖凝胶电泳显影，照相分析结果。半定量标准依据内参照β-actin.

　　六、统计学分析方法

　　采用SPSS10.0软件进行统计学分析，计量数据以x±s表示。组间阳性细胞数（FITC）计算阳性细胞百分比比较，采用单因素方差分析法，组间各指标的多重比较采用最小显着差法（LSD）t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。