第一章 引 言
亚东鲑（Salmo trutta）隶属于鲑形目（Salmoniformes）鲑科（Salmonidae）鲑亚科（Salmoninae），系与褐鳟（Salmo trutta）同物异名，冷水性鱼类，生活史分为洄游型和湖泊居住型[1].
1.1 褐鳟简介及其研究概况
1.1.1 生物学特性
1.1.1.1 形态特征
体形为纺缍形，略侧扁，头小而尖，嘴大，体被细小圆鳞。身体腹部为银白色，背部为黑色，蓝色小圆斑密布在头背，体侧上方，背鳍和尾鳍上。臀鳍颜色较淡，胸鳍和腹鳍的外面颜色较白，里面较浅。牙齿短小尖细，舌大且宽，舌端钝。具有发达的假鳃。
1.1.1.2 生活习性
褐鳟喜好栖息于水温较低的淡水中，尤其是多山的溪流。生长最适水温为10-16℃，高于 16℃时，食欲不振，繁殖能力减弱，当水温高于 23℃时，可能导致死亡。
1.1.1.3 繁殖力对于褐鳟来说，很容易进行人工授精。褐鳟的精子可以进行冷冻保存[2-4],解冻的精子有时候受精率较高（27-95%）。所产卵的数量和质量决定了雌鱼的繁殖力。雌性褐鳟的产卵量平均为 1000-2000 粒/千克。
1.1.2 地理分布
亚东鲑与褐鳟同物异名，原产于欧洲、北非和西亚一些地区[5],褐鳟的自然分布包括冰岛，不列颠群岛和欧洲大陆，从西班牙向东到阿富汗、俄罗斯，北至挪威和北俄罗斯（图 1-1）。在南部，褐鳟分布在地中海沿岸国家，欧洲和北非[6].
在阿尔卑斯山和喀尔巴阡山脉大的湖泊中以及斯堪的纳维亚和冰岛的许多湖泊里发现大的褐鳟。在十九世纪后期和二十世纪前半期，褐鳟被大量引入到其它地区，地理分布从欧洲遍及全球，截至目前已被引入到至少 30 多个国家和地区（图 1-2）[7].例如：非洲、南美、北美、亚洲（巴基斯坦、印度和日本）、新西兰和澳大利亚。1883 年开始引入美国（缅因州），一年后褐鳟的卵被运往加拿大（纽芬兰）。
国内亚东鲑仅在西藏亚东地区有分布，系英国人于十九世纪中期放流至亚东当地河流中。
1.1.3 国际养殖状况及国内研究现状
褐鳟作为世界范围内重要的水产养殖对象，是最早的鲑鳟鱼类养殖品种之一。
大概在 1739 年，雅可比第一次在德国对褐鳟进行人工繁殖。1841 年在英国哈默史密斯地区建立了最早的褐鳟孵化场[9].在十九世纪五十年代，随着人工受精技术的优化，褐鳟养殖在欧洲范围内广泛传播，并引入到其它大陆。褐鳟已成为鲑科鱼类中重要的商业鱼类之一。
目前，国内对亚东鲑生物学特性的研究较少，已见报道的研究主要包括以下几个方面。1962 年，张春霖和王文滨[10]
首次报道了亚东河中亚东鲑的分布状况。
武云飞等[11]和彭仕盛等[12]先后观察研究了其形态学特征。蒲德永等[13]通过对亚东鲑的消化系统研究表明消化系统包括消化腺和消化道，消化腺包括胰腺和肝脏，肝小叶有明显分界，消化道分为明显的肠、胃和食道等。豪富华等[14]通过对亚东鲑胚胎发育的研究把整个发育过程分为 10 个时期，同时表明积温与胚胎发育的天数呈线性关系。豪富华等[15]首次对西藏河流中亚东鲑的生长特点进行了研究，运用 VonBertalanffy 方程对雌性和雄性体长和体重的差异进行估算。孟玮等[16]通过测定分析亚东鲑线粒体 COI 基因序列发现可以利用线粒体 COI 基因作为条形码对亚东鲑、大西洋鲑和红点鲑进行分类鉴定。豪富华等[7]利用微卫星标记和线粒体引物对丹麦引进种群和亚东鲑群体进行种群遗传多样性方面的研究，发现亚东鲑引入高原河流后，亚东鲑的遗传结构未发生显着变化。李福贵等[17]基于线粒体 COⅠ和COⅡ序列对亚东鲑野生和养殖群体进行了遗传多样性的分析。郭秀明等[18]对亚东鲑基因组中 TcⅠ-like 转座子克隆并进行序列歧化特征分析。
1.1.4 褐鳟遗传育种研究
褐鳟是最早进行数量性状变异研究的鲑鳟鱼类之一，在 1919 年，一项研究证实了褐鳟椎骨数量的遗传力[19],之后一些性状被广泛研究。体表色斑显示了良好的遗传，背侧区黑斑的数量遗传力为 0.40[20]以及红斑数量遗传力为 0.67-0.73[21,22].一些外部性状如幽门盲囊的数量[23]和游泳性能[24]在某种程度上与遗传有关。通过选择育种研究生长率的遗传学揭示了一个已经实现的遗传力是 0.3-0.5[25],在不同品系之间会有变化[26].野生和养殖品系之间杂交后代的性状介于亲本之间，稚鱼生长时期表现出明显的杂交优势（d?=0.34-0.39）[27].褐鳟和美洲红点鲑杂交后代在淡水中生长良好，不适应海水，所以没有在实践中应用。早期关于褐鳟三倍体的研究，获得三倍体的比例相对较低[28]或者存活率低[29],28℃热休克 10 分钟可获得90%以上的三倍体。和成熟的二倍体雌性相比，三倍体生长率不会降低。同工酶、线粒体 DNA 和微卫星都可以用于研究褐鳟的遗传变异[30-32].应用 288 微卫星和13 个同工酶绘制了褐鳟的遗传图谱[33].
1.2 线粒体 DNA 测序分析和微卫星分子标记技术
1.2.1 线粒体 DNA 测序分析
线粒体 DNA（mtDNA）测序分析是一种作用于线粒体 DNA 的分子标记，它主要是利用特定的线粒体引物对目的片段进行扩增，然后再对 PCR 扩增产物进行测序，用相关软件（如 MEGA,PHYLIP 等）分析测序结果。它的作用主要是分析物种亲缘关系的远近和应用于系统发生地理学。
1.2.2 微卫星分子标记
1.2.2.1 微卫星分子标记的定义及特点
微卫星 DNA （Microsatellite Repeats）是由几个碱基为核心序列组成的多次串联重复序列也称为简单序列长度多态性（SSLP）或简单重复序列（SSRs）[34].由于等位基因重复次数和重复程度的不同而形成多态性，突变率较高，在物种演变进化过程中积累了丰富的变异[35,36].微卫星 DNA 通过 PCR 得到的扩增结果可直接用于分析多态性。
微卫星分子标记的特点总结如下：微卫星具有较高的多态性，变异丰富；等位基因符合孟德尔遗传规律，共显性表达；数量众多且广泛分布在基因组内；微卫星引物具有较强的通用性[37].此外，操作程序简单，技术稳定可靠，因此微卫星是公认的具有较大应用价值的遗传标记技术。
1.2.2.2 微卫星分子标记在鱼类研究中的应用
近年来，微卫星较多的应用在鱼类的研究中[38],主要包括在：种群遗传结构、遗传多样性、基因克隆、亲权鉴定以及遗传图谱构建等。全迎春[39]等分别用 12 个斑马鱼微卫星标记和 12 对鲤鱼微卫星引物，检测黑龙江鲤、松浦鲤、散麟镜鲤、荷包红鲤抗寒品系的种群遗传多样性。结果表明，这四个群体均具有较高的遗传多样性，然而各个群体间遗传多样性不存在明显差异，说明在养殖环境中群体稳定性良好。葛会争等[40]利用 8 对微卫星引物对黑龙江野鲤与德国镜鲤正反交组合进行了亲子鉴定，进而判断血缘关系。2000 年中国水产科学研究院黑龙江水产研究所孙效文研究员等[41]利用黑龙江鲤和柏氏鲤的杂交F2代单倍体构建了我国首个关于水产生物的遗传连锁图谱。
1.3 养殖密度对鱼类的影响
作为一种环境胁迫因子，高密度养殖对鱼类的存活、生长、摄食、免疫等生命活动有重要的影响。目前关于环境胁迫对鱼类影响的研究表明，养殖密度过高时，会引起鱼类的应激反应。在实际生产中，通过研究养殖密度对鱼类的影响，可以进一步丰富和完善人工养殖技术并优化鱼类养殖模式，进而提高养殖产量和经济效益。
1.3.1 养殖密度对鱼类的影响机制
养殖密度对鱼类的影响机制可以归纳总结为以下两点：（ 1） 养殖密度过高时，使鱼类机体处于应激状态，可以改变其内部生理状况，同时导致种内对水域空间和食物资源的竞争更加激烈，从而降低养殖群体的生长率和存活率，增大鱼病发生的可能性；（2）随着养殖密度不断上升，养殖鱼类的代谢废物增多同时消耗更多的溶氧，导致水体中出现铵态氮含量上升、PH 偏高或过低以及溶氧下降等现象，造成水质恶化，这种不良的水体环境会直接影响鱼类的生存和生长，从而达不到预期的效果[42-46].
1.3.2 养殖密度对鱼类生长的影响
一般认为，鱼类的生长具有密度依赖性[47].有研究表明当养殖密度过大会导致拥挤胁迫及对饵料和空间的竞争，鱼类的活动消耗增加以及摄食量相对减少，鱼类代谢能量消耗增加，从而对鱼类生长造成负面影响[48].还有学者认为，高密度条件下鱼的生长受到抑制，也可能是由于鱼的个体差异造成的，如年龄、性别和生活经历等。江仁党通过对虹鳟稚鱼的研究发现，其全长体重生长速度都随着养殖密度的增大而降低[47].李大鹏等在史氏鲟稚鱼的的养殖试验中发现其特定生长率与养殖密度之间呈负相关关系[49].于森等通过鲤鱼的拥挤胁迫试验中发现，高密度组的特定生长率和最终体重显着低于低密度组[50].
1.3.3 养殖密度对鱼类营养的影响
养殖密度过高时会影响鱼体正常的新陈代谢，改变机体内营养物质和能量的积累，从而改变鱼体的生化组成。肝脏作为鱼类储存营养物质的重要器官，在营养物质代谢中发挥着重要作用，其指标可以作为鱼类能量储存水平评价的一个粗略指标。步艳等[51]通过对大杂交鲟幼鱼的研究中发现在整个实验的后期，随着密度增大其肝体指数呈下降趋势，Vijayan 等[52]研究表明养殖密度过高时溪点红鲑的肝脏指数及肝脏质量降低，这可能是由于高密度养殖条件下，为了满足能量消耗导致肝脏储存脂肪被大量动用。
1.3.4 养殖密度对鱼类免疫功能的影响
养殖密度过高时，导致鱼类由于拥挤胁迫而产生应激反应，当鱼体长时间处于应激状态时，体内原有的平衡状态被打破，一些生理生化指标出现变动，生理功能发生紊乱，在一定程度上损伤免疫器官，引起鱼体免疫机能下降甚至发生鱼病[53].
脾脏作为鱼体的免疫器官，能够产生各种免疫细胞。Rosenthal 等[54]发现随着养殖密度增大，虹鳟的脾脏显着减小。王文博等[55]研究结果表明试验 60d 后，中、高密度组草鱼的脾脏受到严重损伤，其原因可能是高密度条件下水质恶化。免疫细胞包括吞噬细胞和淋巴细胞[56].有研究表明随着养殖密度的增大褐鳟（Salmotrutta）和斑点叉尾鮰（Ietalurus punetaus）的白细胞数量下降，淋巴细胞和血小板数量减少[57-59].
1.4 肌肉营养品质
鱼肉作为高蛋白、低脂肪、富含矿物质和维生素的肉制品，风味佳、易于消化吸收，因此鱼肉一直是人体蛋白的优质来源。在其营养成分中蛋白质和脂肪的含量决定了营养价值的高低。氨基酸和脂肪酸分别作为蛋白质和脂肪的基本组成单位，其组成比例和含量与肌肉品质关系密切。
1.4.1 氨基酸的分类
从营养学角度对氨基酸进行分类，可分为必需氨基酸（Essencial amino acids,EAA） 、 半 必 需 氨 基 酸 （ Semi-essential amino acid, SAA） 和 非 必 需 氨 基 酸（Non-essencial amino acids, NEAA）。 EAA 指人体（或其它脊椎动物）不能合成或合成速度远远达不到机体的需要，需由食物蛋白供给。SAA 是人体虽能够合成，但合成的量不能满足正常需要。NEAA 指人（或其它脊椎动物）可以通过简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨基酸。
1.4.2 蛋白质营养
营养学理论通常认为，食品蛋白质营养价值的评价主要有三点：一是食物中蛋白质的含量；二是蛋白质中含有的氨基酸种类和数量， 尤其是必需氨基酸的组成比例和含量；三是有机体对食品蛋白质的利用和消化程度[62,63].
参考 FAO/WHO 提出的每克氨基酸评分标准模式[64]和中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所提出的全鸡蛋蛋白氨基酸评分模式[65],将必需氨基酸含量（占干样）换算成每克氮中氨基酸含量进行比较，计算氨基酸评分（AAS）、化学评分（CS）和必需氨基酸指数（EAAI）[66],从而对蛋白质进行营养价值评价。此外，氮平衡指数和相对蛋白质值等指标也可用来评价蛋白质。
1.4.3 脂肪酸的分类
根 据 碳 链 长 度 的 不 同 , 脂 肪 酸 可 分 为 短 链 脂 肪 酸 （short chain fattyacids,SCFAs），指小于 6 个碳原子分布在碳链上，中链脂肪酸（Midchain fatty acids,MCFAs），即碳链上碳原子数为 6-12 个，长链脂肪酸（Longchain fatty acids, LCFAs），指碳原子数大于 12 的脂肪酸。根据碳氢链是否饱和以及饱和程度可分为三类，即：
饱和脂肪酸（Saturated fatty acids, SFAs），没有不饱和键；单不饱和脂肪酸（Mono-unsaturated fatty acids, MUFAs），有一个不饱和键在碳链上；多不饱和脂肪（Poly-unsaturated fatty acids, PUFAs），其碳氢链有不少于两个不饱和键；高不饱和脂肪酸（Highly-unsaturatedfatty acids, HUFAs），指不饱和键数不少于 3 且碳链长度大于 20 的 PUFAs[60,61].
1.4.4 脂肪酸的功能
有研究表明，单不饱和脂肪酸在调节血脂、保护心脏、降低胆固醇和血糖以及防止记忆衰退等诸多方面发挥着重要的作用[67];多不饱和脂肪酸可以预防和治疗心脑血管疾病，促进生长发育，调节脂质代谢，而且具有延缓衰老、调节免疫、抗癌等重要作用[68].其中 EPA 和 DHA 是最为重要的不饱和脂肪酸，大多数以三酸甘油脂的形式存在，人体不能合成。目前世界公认 EPA、DHA 具有抗衰老、抗氧化和降低血清胆固醇的作用。资料显示 EPA 和 DHA 可用于提高记忆力，对治疗老年性痴呆有一定作用，而且 EPA 和 DHA 可抗过敏、促进视网膜生长修复，防止视力下降等[69-71].
1.5 本研究目的和意义
亚东鲑是西藏地区重要的经济鱼类，其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，开发利用前景广阔。近年来，去西藏旅游人数剧增，刺激了亚东鲑的商业需求，但是由于亚东鲑养殖产量过低，不能满足市场需求。而且亚东鲑自然分布地理区域较小，自然捕捞强度过大，造成野生种群数量日趋下降。因此，目前急需保护亚东鲑种质资源保护以及进行种群增殖。目前国内关于亚东鲑生物学特性的研究资料很少，主要集中于形态特征、繁殖生物学和分子生物学等方面[13-18].因此本研究着重从分子生物学和养殖生物学方面对褐鳟日本品系和亚东鲑 2 个群体进行分析，为可持续地开展人工养殖以及种质资源的保护和遗传改良提供理论依据。
1、利用 mtDNA 测序探讨褐鳟日本品系和亚东鲑两个种群的起源并利用微卫星技术分析 2 个群体的遗传多样性和分化，以期为该物种的资源保护与合理开发利用提供遗传学方面的理论依据。
2、通过研究日本品系褐鳟稚鱼生长与其养殖密度间关系，揭示不同养殖密度条件下对其稚鱼生长影响，完善人工养殖技术，为生产实践提供科学参考。
3、对亚东鲑肌肉营养成分进行分析，并进一步评价其品质，为亚东鲑的营养价值提供确实的理论基础以及配合饲料的开发提供基础资料。
